Análise de OGM. Análise de OGM

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1 técnicas analíticas detectam: porção de DNA do gene inserido PCR (polymerase chain reaction) é método mais usado proteína expressa pelo gene ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) LFS (lateral flow strip tests ) Métodos de análise de proteínas necessários métodos muito sensíveis proteínas expressas a muito baixas concentrações ppm ɼ g/g métodos usados: HPLC electroforese capilar ensaios imunológicos muito sensíveis (ppb, ppt) grande especificidade ELISA LFS western blot MS 1

2 Métodos de análise de proteínas ELISA usa 2 anticorpos um é específico para um antigene outro está ligado covalentemente a uma enzima e reage com complexos antigene-anticorpo quantidade de reagente ligado à enzima que resta após análise depende da quantidade de proteína a analisar existente na amostra presença da enzima demonstrada pela adição de uma solução de uma molécula incolor (substrato) convertida em solução colorida pela enzima cor proporcional ao teor de proteína (antigene) ensaio sandwich ensaio competitivo elisa.mov Métodos de análise de proteínas ELISA sandwich anticorpo ligado à proteína é imobilizado numa superfície sólida placa de micro-titulação de 96 poços normalmente poliestireno permite processamento simultâneo de várias amostras material a ser testado é extraído e tamponizado anticorpo na placa é incubado com amostra captura proteína a analisar na amostra 2

3 Métodos de análise de proteínas ELISA sandwich adiciona-se anticorpo detector liga-se ao antigene junta-se anticorpo ligado a uma enzima liga-se ao anticorpo detector adiciona-se o substrato convertido em forma detectável pela enzima Métodos de análise de proteínas ELISA sandwich cor resultante indica concentração do antigene presente na amostra directamente proporcional 3

4 Métodos de análise de proteínas LFS muito simples permite determinar se concentração de uma proteína está acima ou abaixo de um dado patamar teste de gravidez semelhantes aos ELISA sandwich usa pequenas esferas coloridas ligadas aos anticorpos para produzir um sinal positivo amostra separada da proteína alvo por imobilização do anticorpo de captura numa membrana porosa amostra atravessa anticorpo imobilizado por capilaridade da membrana ELISA mais sensível que LFS devido à presença da enzima nalguns casos LFS pode detectar até ppb LFS Métodos de análise de proteínas 4

5 Métodos de análise de proteínas LFS imobiliza-se um anticorpo capaz de se ligar à proteína alvo numa zona da membrana porosa outro anticorpo capaz de se ligar à proteína reveste a superfície de pequenas esferas coloridas secas e colocadas antes da zona de teste quando amostra líquida as reconstitui, fluem por capilaridade junto com amostra proteína da amostra liga-se à partícula com o anticorpo atravessa a membrana até ser capturada pelo anticorpo imobilizado na zona de teste vai-se formando uma linha colorida indica presença de antigene na amostra Métodos de análise de proteínas Western blot usado sobretudo em laboratório combina 2 tecnologias electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) separa diversas proteínas numa mistura, segundo PM ensaio imunológico detecta proteína específica após separação detecção até ao nível de picograma 5

6 Métodos de análise de proteínas Western blot preparação da amostra para PAGE aquecer em tampão contendo agentes redutores e detergentes desnaturação proteica amostra aplicada no gel e separada por electroforese Métodos de análise de proteínas Western blot proteínas transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose incubada com solução de complexo anticorpo-enzima formação de banda corada na zona em que proteína fica imobilizada cálculo de PM por comparação da posição relativamente a outras proteínas de PM conhecido 6

7 Métodos de análise de proteínas Western blot só reage com proteínas desnturadas análise de alimentos muito processados capaz de determinar teores muito baixos de proteína Métodos de análise de DNA diversos ensaios de PCR dão resultados qualitativos ou quantitativos mais usado é o teste de varrimento varrimento da molécula de DNA para encontrar as sequências de iniciação e terminação do gene inserido 7

8 Métodos de análise de DNA Métodos de análise de DNA PCR detecção de características genéticas não aprovadas detecção de mistura de alimentos OGM e não OGM necessária extracção de DNA de boa qualidade a partir da amostra por vezes difícil em alimentos muito processados mais fácil em alimentos não processados amostras bem homogeneizadas 8

9 Métodos de análise de DNA PCR DNA extraído é amplificado por PCR pequena cadeia de DNA sintético (primer) sequência complementar à do DNA alvo incubação e replicação até produção de cópias suficientes para permitir detecção separação e reacção com produção de cor identificação e quantificação da % OGM electroforese em gel comparação com padrão Métodos de análise de DNA PCR caracterização do DNA pode ser feita por: digestão com enzimas de restrição hibridização com sondas sequenciação do DNA só efectuadas em casos específicos raramente na análise de alimentos análise por PCR pode ser automatizada e simplificada por utilização de kits 9

10 Métodos de análise de DNA PCR análise quantitativa usada quando legislação obriga a rotulagem acima de determinada concentração gene endógeno (do material hospedeiro) tem que ser incluido na análise serve de gene de referência permite calcular teor de OGM mesmo nº de cópias para todas as variedades de planta a ser testadas carcterístico para a espécie e não reagir com variedades relacionadas métodos baseados em PCR competitiva (real-time PCR) Métodos de análise de DNA PCR real-time PCR semelhante a PCR normal efectuada em tubo selado variação na concentração dos produtos de reacção seguida através de sondas fluorescentes sondas hibridizam com secções de DNA das novas cadeias valores permitem calcular quantidades de DNA modificado relativamente ao da planta hospedeira 10

11 Métodos de análise de DNA PCR PCR específico quando é necessário identificar a origem do material geneticamente modificado (organismo) avaliar da existência de características não aprovadas para uso primers desenhados para identificar regiões do genoma que representam tanto o DNA nativo como o DNA transgénico ambos identificados num único tubo de reacção ensaio pode ser qualitativo ou quantitativo 11

12 Análise de pesticidas métodos de resíduos múltiplos (MRMs) usados para detectar e medir múltiplos resíduos em diversos alimentos capazes de dar estimativas de confiança para maioria dos pesticidas a níveis iguais ou inferiores aos de tolerância integram passos de: preparação da amostra extracção purificação separação cromatográfica com detecção on-line quantificação automática Análise de pesticidas métodos de resíduos múltiplos FDA e USDA usam 10 méodos 8 com GC 2 com HPLC nenhum MRM capaz de detectar todos os tipos de resíduo em todos os tipos de alimento compromisso entre nº de reíduos, gama de alimentos e níveis de resíduos mensuráveis principal vantagem variedade de resíduos que pode ser determinada 12

13 Análise de pesticidas Análise de pesticidas métodos de resíduo único (SRMs) usados para medir um único analito também usado para medir seus metabolitos principais e produtos de transformação com relevância toxicológica geralmente usam mesmos passos que MRMs cada passo optimizado para analito de interesse geralmente mais rápidos e com limites de detecção mais baixos que MRMs 13

14 Análise de pesticidas métodos semiquantitativos e qualitativos capazes de detectar um nº limitado de resíduos de pesticidas semelhantes também designados métodos de varrimento capazes de analisar um grande nº de amostras para a presença d um nº limitado de resíduos de pesticidas num curto período de tempo métodos semiquantitativos dão uma estimativa da gama de concentrações de um resíduo métodos qualitativos detectam pesticidas presentes acima de um nível pré-determinado métodos baratos, rápidos e simples usam: TLC inibição enzimática ensaios imunológicos Análise de pesticidas métodos quantitativos passos básicos preparação da amostra planta separada em fracções comestíveis e não comestíveis cortadas, trituradas ou maceradas extracção solvente adequado filtração isolamento purificação do extracto bruto separação componentes do extracto purificado separados por partição entre fases móvel e estacionária detecção e quantificação características físicas dos componentes separados na fase móvel medidas num detector sinal relacionado com concentração 14

15 Análise de pesticidas métodos quantitativos preparação da amostra pesticidas ocorrem como resíduos na superfície das plantas distribuição não uniforme pode haver contaminação de tecidos interiores se existirem danos na superfície frutos e legumes não são lavados antes da análise apenas remoção de folhas externas danificadas quando película externa não é consumida, removem-se 2 3 mm externos cebolas, melões, kiwis,... sementes e pedúnculos removidos degradação de pesticidas pode ser acelerada por maceração da amostra partículas de solo ou outros contaminantes visíveis podem ser removidos por acção mecânica suave Análise de pesticidas métodos quantitativos extracção objectivo: recuperar máxima quantidade possível de analito numa solução solventes usados: acetonitrilo ou acetona adição de sal anidro (NaCl, Na 2 SO 4 ) para absorver água OU adição de água para facilitar purificação por partição contra outro solvente orgânico pode ocorrer formação de emulsões minimizado por adição de um sal à fase aquosa podem ser destruídas por centrifugação 15

16 Análise de pesticidas métodos quantitativos extracção (processo alternativo, mais simples) amostra colocada numa suspensão com ~70% H 2 O adicionam-se acetonitrilo e diclorometano ou acetona e éter de petróleo junta-se NaCl agita-se fortemente fase orgânica seca sobre Na 2 SO 4 redução de volume, diluída em solvente adequado e de novo concentrada passos repetidos até completa remoção dos solventes de extracção podem interferir com detector concentrado pode ser directamente injectado em GC Análise de pesticidas métodos quantitativos isolamento extracto bruto parcialmente purificado antes da separação analitos separados de interferentes na detecção grau de isolamento depende do tipo de detector e da cromatografia passo mais moroso e mais sensível a erros extracto bruto (água-acetona ou água-acetonitrilo) particionado contra solvente orgânico relativamente apolar fase orgânica levada à secura resíduo pode ainda ser purificado por cromatografia em coluna adsorção ou exclusão molecular depende do analito e da matriz 16

17 Análise de pesticidas métodos quantitativos isolamento (técnicas alternativas) extracção em fase sólida (SPE) pequenas quantidades de material de empacotamento em pequenas colunas ou discos não reutilizáveis purificar concentrar derivatizar menos frequente Análise de pesticidas métodos quantitativos isolamento (técnicas alternativas) microextracção em fase sólida (SPME) fibras revestidas com um polímero imersas em extracto aquoso ou retidas no espaço de cabeça de uma amostra analitos difundem para polímero após equilíbrio, fibra colocada no injector do GC desorção térmica dos analitos para a coluna 17

18 Análise de pesticidas métodos quantitativos isolamento (técnicas alternativas) extracção assistida por micro-ondas tempo de extracção e volume de solvente fortemente reduzidos operação a temperatura superior ao ponto de ebulição do solvente transferência rápida do analito para a fase do solvente Análise de pesticidas métodos quantitativos isolamento (técnicas alternativas) extracção acelerada pequenas quantidades de solventes a temperatura e/ou pressão elevadas até 200 ºC e MPa tempos curtos de operação < 10 min 18

19 Análise de pesticidas métodos quantitativos derivatização normalmente pré-coluna por vezes pós-coluna diversas reacções de derivatização para pesticidas Análise de pesticidas métodos quantitativos separação GC colunas de empacotamento colunas capilares melhor resolução melhores limites de detecção colunas megabore intermédias entre capilares e de empacotamento melhores características de ambos os formatos elevada resolução, mesmo a fluxo elevado maior capacidade que as capilares 19

20 Análise de pesticidas métodos quantitativos separação GC detectores tiram partido do facto de a maioria dos pesticidas conterem heteroátomos (não H, C, O) FID (ionização de chama) S ou P ECD (captura electrónica) halogéneos, S, N condutividade halogéneos, S, N termo-iónicos N, P MS elevada selectividade qualitativa e quantitativa Análise de pesticidas métodos quantitativos separação GC padrão interno mais usado: clorpirifos pesticida bem separado na maioria das colunas detectado em todos detectores de GC 20

21 Análise de pesticidas métodos quantitativos separação HPLC restrito a analitos não voláteis ou termicamente instáveis N-metil carbamatos vantagem: isolamento dos analitos é menos extenso detectores: UV fluorescência por vezes necessário derivatizar pré ou pós-coluna Análise de pesticidas métodos quantitativos confirmação química confirmação da detecção para aumentar grau de confiança mais eficaz seria obtenção de resultdos concordantes usando 2 métodos independentes, baseados em princípios analíticos diferentes não é possível para MRMs alternativas: GC-MS para obter espectro do analito e estimativa do teor 2 detectores selectivos 2 colunas com fases diferentes analito derivatizado e recromatografado sinal do analito desaparece e é substituído por outro 21

22 Análise de pesticidas métodos quantitativos ensaios imunológicos anticorpos com elevada afinidade para o analito elevada selectividade simplicidade rapidez custo moderado requer muito trabalho e tempo anticorpos desenvolvidos para um pesticida podem reagir com outra molécula semelhante maioria dos pesticidas são pouco solúveis em água tampões aquosos usados em ensaios imunológicos Análise de pesticidas métodos semiquantitativos e qualitativos TLC menor resolução que GC uso para teste semiquantitativo de grupos limitados de pesticidas detecção de pesticidas inibidores de colinesterases enzimas inibidas por organofosfatos e carbamatos HPTLC permite melhores resultados 22

23 Análise de micotoxinas produtos naturais tóxicos para outros organismos metabolitos secundários produzidos por bolores podem ser produzidas quer no campo quer em armazenamento moléculas pequenas (PM < 1000) toxicidade muito variável aflatoxina B 1 Análise de micotoxinas amostragem amostras de grande dimensão para reduzir erros trituradas para homogeneizar 23

24 Análise de micotoxinas análise química preliminar processos não quantitativos cromatografia em minicoluna TLC dão indicação preliminar sobra a presença do analito Análise de micotoxinas cromatografia em minicoluna explora fluorescência natural de algumas micotoxinas aflatoxinas, zearalenona, ocratoxina A colunas pré-empacotadas disponíveis comercialmente extracto sujeito a isolamento parcial e eluído na coluna com vários solventes toxina visualizada como banda fluorescente sob luz de 365 nm limite de detecção de ppb (ng/g) 24

25 Análise de micotoxinas TLC podem ser analisadas diversas amostras na mesma placa requer menos padrões permite estimativa grosseira dos teores de toxina ajuste do volume de extracto para análise quantitativa posterior pode existir coeluição reduzida pela utilização de TLC 2D menos amostras na mesma placa requer utilização de padrões em cada ensaio Análise de micotoxinas processos químicos quantitativos mesmo tipo de procedimentos que para pesticidas extracção filtração isolamento concentração separação cromatográfica detecção e quantificação confirmação 25

26 Análise de micotoxinas extracção amostra misturada com MeOH aquoso, acetona e/ou acetonitrilo alimentos ricos em gordura requerem eliminação de lípidos extracção com hexano ou isooctano antes, durante ou depois da solubilização da micotoxina filtração remoção de sólidos em suspensão Análise de micotoxinas isolamento partição por solvente cromatografia em coluna precipitação aniónica remoção de pigmentos e substâncias proteicas pp induzida com ácido fosfotungstico e sais de Zn, Pb e NHŸ limitada a extractos em solventes orgânicos polares, contendo > 55% H 2 O concentração 26

27 Análise de micotoxinas separação 2D-TLC HPLC mais popular detecção por UV ou fluorescência derivatização pré ou pós coluna de fase reversa para aumentar a resposta da fluorescência sensibilidade: ppm GC apenas em poucos casos Análise de micotoxinas métodos bioquímicos ensaios imunológicos ensaios rádio-imunológicos (RIA) ELISA detecção ao nível do pg - ng rápidos simples fiáveis 27

28 Análise de micotoxinas separação por imunoafinidade utilização de anticorpos para isolar toxinas a partir de matriz biológica simples grau de isolamento superior a métodos tradicionais existem colunas comerciais preparadas material de empacotamento adsorve selectivamente as toxinas a partir de um extracto bruto técnica de concentração analitos libertados com um solvente orgânico polar Análise de micotoxinas separação por imunoafinidade cromatografia pode usar anticorpos monoclonais passo de isolamento antes da determinação fluorimétrica de aflotoxina M 1 no leite leite misturado com NaCl centrifugado e filtrado aliquota cromatografada sob ligeira pressão positiva analito eluído analisado por fluorescência 28

29 Análise de resíduos de medicamentos medicamentos administrados em doses terapêuticas combater doenças em animais produtores de alimentos medicamentos antimicrobianos administrados em doses subterapêuticas antibióticos risco devido a: bactérias resistentes transmissão de resistência a humanos métodos químicos para resíduos múltiplos são limitados dirigidos a classes específicas de resíduos Análise de resíduos de medicamentos ensaios preliminares tradicionais inibição do crescimento microbiano por resíduos de antibióticos presentes na amostra processos de difusão ou baseados em turvação ensaios imunológicos nalguns casos também quantitativos podem ser totalmente manuais ou parcialmente automatizados simples rápidos análise de grande nº de amostras não específicos respondem apenas a resíduos biologicamente activos 29

30 Análise de resíduos de medicamentos ensaios baseados na turvação do meio turbidez de um meio de cultura aumenta ao longo do tempo de crescimento de um organismo indicador Análise de resíduos de medicamentos ensaios baseados em processos de difusão material a analisar difunde através do meio de crescimento, cultivado com esporos do organismo indicador após incubação, surge uma zona de inibição de germinação e crescimento indica presença de inibidor 30

31 Análise de resíduos de medicamentos determinações químicas quantitativas metodologia idêntica à utilizada para outros analitos residuais pré-tratamento da amostra libertação dos resíduos ligados resíduos solubilizados num solvente adequado extracto bruto purificado partição ou cromatografia em coluna análise cromatográfica HPLC é técnica mais usada menor preparação de amostra que para GC Análise de contaminantes sujidades pesadas separadas por sedimentação areia, terra, excrementos de insectos, roedores e outros animais leves lipofílicas insectos e seus fragmentos, pelos e fragmentos de roedores e bárbulas de penas peneiradas diferentes tamanhos, separadas por peneiras substâncias resultantes da putrefacção ou decomposição do alimento materiais estranhos adulterantes lubrificantes partículas de metal... introduzidos intencionalmente ou por defeito no processamento 31

32 Análise de contaminantes identificação de contaminantes de pequenas dimensões pode ser difícil isolamento pode ser simples ou complicado depende do contaminante e do alimento perca de fragmentos e variações devidas ao analista minimizadas por utilização de técnicas e métodos padronizados Análise de contaminantes Métodos sujidade pesada por sedimentação em frutos secos pesar amostra adicionar éter de petróleo e aquecer extrair lípidos para preparar amostra para análise de sujidade leve perfazer volume perdido com mais éter de petróleo decantar solvente adicionar CHCl 3 e deixar repousar retirar material flutuante (miolo) e ~⅔ do CHCl 3 repetir separação com pequenos volumes de CHCl 3 :CCl 4 (1:1) pedaços de casca, areia e solo sedimentam por diferença de densidade miolo flutua até resíduo estar livre de partículas do fruto 32

33 Análise de contaminantes Métodos sujidade pesada por sedimentação em frutos secos transferir resíduo para papel livre de cinzas procurar sujidade pesada contar nº de partículas cascas, areia, solo Análise de contaminantes Métodos fragmentos de insectos e pelos de roedores em farinha de centeio contaminantes lipofílicos extraídos para fase oleosa de uma mistura heptano/álcool num frasco de Wildman outras partículas podem ficar retidas na fase de heptano como interferentes método utiliza 2 reagentes para impedir esse fenómeno solução de Tween 80 (mistura alcoólica) solução de Versene (à base de EDTA) 33

34 Análise de contaminantes Métodos método de flotação para determinar sujidade leve em farinha fragmentos de insectos, pelos de roedores e outras digestão ácida degrada o amido permite separação dos restantes constituintes sujidade retida numa fase oleosa separada com papel de filtro sedimentos mais pesados, resultantes da digestão, lavados e retirados Análise de contaminantes Métodos existem poucos métodos oficiais para isolamento de contaminantes métodos alternativos radiografia de raios X inspecção de trigo para contaminação interna por insectos medição de ácido úrico nas amostras contaminação por excrementos de insectos ou pássaros permite automação ELISA medida quantitativa de material proveniente de insectos medida da miosina produzida pelos insectos permite automação espectroscopia NIR contaminação interna por insectos no trigo permite automação 34

35 Análise de contaminantes Métodos métodos alternativos técnicas de microscopia microscopia de fluorescência microscopia electrónica de varrimento determinação de metais, plásticos, vidro, fibras, 35