PROPAGAÇÃO IN VITRO DE CUPUAÇUZEIRO: desinfestação de explantes florais

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1 37 PROPAGAÇÃO IN VITRO DE CUPUAÇUZEIRO: desinfestção de explntes floris IN VITRO PROPAGATION OF Theobrom grndiflorum (cupuçu tree): surfce steriliztion of florl explnts Mri ds Grçs Rodrigues Ferreir 1 Murício Reginldo Alves dos Sntos 2 An Cleide Ribeiro Brgdo 3 RESUMO: O trblho teve como objetivo desenvolver um protocolo pr desinfestção de explntes floris de cupuçuzeiro, visndo o seu estbelecimento in vitro. Botões floris fechdos, oriundos de cupuçuzeiros sem sementes, form lvdos com águ destild e imersos em álcool 70% (v/v) por um minuto. Em câmr de fluxo, os botões form imersos em hipoclorito de sódio 0,25 e 0,50%, durnte 20 e 30 minutos, e lvdos três vezes com águ estéril. Os botões form segmentdos em pétl, estminóide, lígul e ovário, os quis form inoculdos em meio MS contendo ágr (8 g.l -1 ), com e sem cefotxim (100 mg.l -1 ). Avliou-se contminção dos explntes nos 20 dis subseqüentes e consttou-se que utilizção de ntibiótico no meio de cultur foi essencil pr o controle d contminção. A fim de reduzir oxidção dos tecidos, devido o mior tempo de exposição o hipoclorito de sódio, recomend-se concentrção de 0,25% e 20 minutos de imersão dos explntes. PALAVRAS-CHAVE: Cultivo in vitro. Hipoclorito de sódio. Cefotxim ABSTRACT: The study imed to develop protocol for the surfce steriliztion of cupuçu tree florl explnts nd its estblishment in vitro. Closed flower buds from cupuçu seedlees were wshed with distilled wter nd immersed in 70% lcohol (v / v) for one minute. In flow chmber, the buds were immersed in sodium hypochlorite t 0.25 nd 0.50% during 20 nd 30 minutes nd wshed three times with sterile wter. The buds were segmenteds in petl, stminode, ligule nd ovry, which were inoculted on MS medium with gr (8 g.l -1 ) in the presence nd bsence of cefotxime (100 mg.l -1 ). It ws evluted the contmintion of explnts fter 20 dys nd observed tht the use of ntibiotic in culture medium ws essencil to control the contmintion. In order to reduce oxidtion of the tissues due to the longer time of exposure to sodium hypochlorite it is recommended concentrtion of 0.25% nd 20 minutes of immersion of explnts. KEYWORDS: In vitro culture. Sodium hypochlorite. Cefotxime 1. INTRODUÇÃO O cupuçuzeiro (Theobrom grndiflorum (Willd. ex Spreng.) K. Schum.) destc-se entre s fruteirs mzônics como um ds mis trtivs d região, pels crcterístics de sbor e rom de seus frutos, cuj polp é empregd no prepro de sucos, sorvetes, licores, compots, geléis, cremes, etc. Instituições de 1 Agrônom, Drª, Pesquisdor Embrp Rondôni, BR 364, km 5,5, Porto Velho, RO. CEP E-mil: mgrc@cpfro.embrp.br. 2 Biólogo, Drº, Pesquisdor Embrp Rondôni, BR 364, km 5,5, Porto Velho, RO. CEP E-mil: muricio@cpfro.embrp.br. 3 3 Acdêmic do curso de Engenhri Florestl, Fculdde de Ciêncis Humns, Exts e Letrs de Rondôni, Br 364, Km 6,5, sn - Cmpus FARO. Porto Velho, RO. CEP E-mil: nefo@hotmil.com.

2 38 pesquiss n região Norte têm implementdo progrms de melhormento com ênfse à seleção de mteriis com crcterístics de lt produção de frutos, rendimento de polp e resistênci à vssour de brux (Crinipellis pernicios (Sthel) Singer), principl enfermidde d cultur. Neste contexto, objetiv-se com propgção in vitro, minimizção destes problems pel quisição de mteril propgtivo vegetl livre de fitoptógenos. Outr vntgem d micropropgção é permitir obtenção de mior quntidde de muds em um curto período de tempo, qundo comprdo com propgção vegettiv trdicionl. A primeir etp d micropropgção é o estbelecimento in vitro do mteril ser multiplicdo e, pr tnto, deve-se determinr melhor metodologi pr desinfestção dos explntes serem inoculdos. Após escolh do tecido que será empregdo como explnte, procede-se o trtmento de desinfestção do mesmo, fim de eliminr microorgnismos exógenos, pr obtenção de um bom resultdo no finl do processo de estbelecimento in vitro (GAMBORG & PHILLIPS, 1995; ROCHA; 1999; SOUZA et l., 2003; SILVA et l., 2003). Em espécies lenhoss, contminção dos explntes é um dos principis problems do cultivo in vitro (Pierik, 1990) e depende tmbém d procedênci do mteril vegetl utilizdo, que pode ser de cs de vegetção ou do cmpo. Os níveis de contminção tendem ser miores qundo s plnts mtrizes usds como fonte de explntes são provenientes do cmpo. Contudo, mesmo s plnts submetids o rigoroso controle fitossnitário e mntids em viveiro protegido ou cs de vegetção são fontes potenciis de microorgnismos, que podem tornr-se limitntes os procedimentos de cultivo in vitro (MEDEIROS, 1999). N miori dos csos, presenç de fungos e bctéris ocorre poucos dis pós inoculção. Em lguns csos, presenç de bctéris e fungos ns plnts é detectd pós lgum tempo de cultivo, gerlmente qundo um grnde número de plnts já está em produção. Além disso, por serem de difícil visulizção, são fcilmente trnsmitids de um mteril pr outro durnte mnipulção dos explntes pr inoculção in vitro. Qundo s condições do meio de cultur (nutrição, ph) tornm-se fvoráveis o seu desenvolvimento, os fitoptógenos pssm competir por nutrientes mineris e crboidrtos do meio de cultur (Smith, 2000), comprometendo multiplicção e o desenvolvimento dos explntes (Montrroyos, 2000), podendo levá-los rpidmente à morte. Est deteriorção dos

3 39 explntes está relciond com produção de metbólitos fitotóxicos pelos fitoptógenos, tis como os ácidos láctico e cético e cineto (PEREIRA et l., 2003). Um problem freqüente durnte o isolmento de explntes é oxidção de compostos fenólicos, que são liberdos pels céluls, reltm GRATTAPAGLIA & MACHADO (1998). Segundo Teixeir (2006), oxidção dos polifenóis lev à produção de substâncis mrelds de composição complex, do tipo quinons, que se pode ligr proteíns ds membrns ou enzims, crretndo toxidez e morte d célul. Pr minimizr contminção microbin, inúmeros protocolos de esterilizção são presentdos por diversos utores. Estes reltm o uso de substâncis como hipoclorito de sódio e etnol 70% e, em lguns csos, dição de ntibióticos o meio de cultur (GARCIA & RAFAEL, 1990; LEIFERT et l., 1991;BUCKLEY et l., 1995; TANPRESERT & REED, 1998; REED et l., 1998). A utilizção de ntibióticos pr o controle e errdicção de microrgnismos contminntes é frequente, podendo os mesmos serem diciondos o meio de cultur ou imersão dos em bnhos sob gitção, durnte lguns dis (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). A concentrção d solução desinfestnte e o tempo de exposição podem vrir muito os índices de descontminção, no que se fz necessário à dequção do protocolo de desinfestção. Este trblho teve como objetivo desenvolver um protocolo pr desinfestção de explntes floris de cupuçuzeiro, visndo o seu estbelecimento in vitro. 2. MATERIAL E MÉTODOS Form coletdos botões floris em estágio nterior à ntese, oriundos de plnts de cupuçu sem sementes, coletdos no cmpo experimentl d Embrp Rondôni, em Porto Velho, RO. Os mteriis form conduzidos o Lbortório de Cultur de Tecidos Vegetis, onde pssrm por um pré-limpez, empregndo-se um esponj umedecid com águ destild e lgums gots de detergente comercil. Após esse procedimento, os botões form lvdos com águ destild e, em seguid, colocdos em álcool 70% (v/v) por um minuto. Em câmr de fluxo lminr, os botões floris form retirdos do álcool e esterilizdos com

4 40 concentrções de 0,25 e 0,50% de hipoclorito de sódio, durnte 20 e 30 minutos, sendo, em seguid, lvdos três vezes com águ bidestild estéril e os explntes dispostos em plc de Petri contendo ppel de filtro estéril. Empregndo-se outr plc de Petri estéril, os botões form segmentdos, com jud de bisturi, em pétl, estminóide, lígul e ovário. Esses explntes ficrm imersos em solução ntioxidnte, constituíd por um mistur de 100 mg de ácido scórbico e 150 mg de ácido cítrico, dissolvid em um litro de águ, sendo su esterilizção feit em filtro bcteriológico de 0,22 ou 0,45 micrs, por dez minutos. Em seguid, os explntes form inoculdos em plcs de Petri contendo meio MS (Murshige & Skoog, 1962), sem reguldores de crescimento, crescido de 3,0% de scrose, com e sem cefotxim (100 mg.l -1 ) e solidificdo com ágr (0,8%). Os experimentos form relizdos em delinemento inteirmente csulizdo em esquem ftoril 2 x 2 x 2, combinndo dus concentrções de hipoclorito de sódio (0,25% e 0,50%), dois tempos de imersão (20 e 30 minutos), n presenç e usênci de ntibiótico, consistindo de oito trtmentos. Form empregds três plcs de Petri com meio contendo cinco explntes cd um, totlizndo 15 repetições. Os ddos form nlisdos pelo Teste de Tukey o nível de 5% de probbilidde. As culturs form mntids em sl de crescimento, com fotoperíodo de 8 hors 28 C, durnte 20 dis, sendo vlido o número de explntes contmindos o finl desse período. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Verificmos que n usênci de ntibiótico, empregndo-se 0,25% de hipoclorito de sódio e 20 minutos de imersão (T1), todos os explntes empregdos presentrm s miores porcentgens de contminção (Figur 1). No trtmento 2 (0,25% de hipoclorito de sódio e 30 minutos de imersão), s contminções form menores pens com o emprego de ovário e estminódio, não diferindo esttisticmente pr lígul e pétl, com relção o T1. No trtmento 3 (0,50% de hipoclorito de sódio e 20 minutos de imersão), não houve diferenç significtiv pens com o emprego de estminódio, sendo que os demis explntes presentrm menores porcentgens de contminção, em relção o trtmento 2. O trtmento 4 (0,50% de hipoclorito de sódio e 30 minutos de imersão) presentou

5 41 diferenç significtiv pens pr estminódio, sendo que os demis explntes empregdos não diferirm esttisticmente do trtmento 3. Porcentgens de contmin b b ovário lígul estminódio pétl b b b b c b c 0 c Trtmentos de descontminção Figur 1. Porcentgens de contminção de explntes floris de cupuçu em meio sem utilizção de ntibiótico, imersos em hipoclorito de sódio diferentes concentrções e períodos de imersão. Trtmento 1 0,25% de hipoclorito de sódio e 20 minutos de imersão; Trtmento 2-0,25% de hipoclorito de sódio e 30 minutos de imersão; Trtmento 3 0,50% de hipoclorito de sódio e 20 minutos de imersão; Trtmento 4 0,50% de hipoclorito de sódio e 30 minutos de imersão. Letrs diferentes indicm significânci 5%, pelo teste de Tukey. Porto Velho, Embrp Rondôni, N Figur 2 observmos os resultdos d descontminção dos explntes n presenç de ntibiótico. Com exceção do Trtmento 5 (0,25% de hipoclorito de sódio e 20 minutos de imersão), os explntes não presentrm contminção nos demis trtmentos testdos. Contudo, utilizção de concentrções miores de hipoclorito de sódio (0,50%) e mior tempo de imersão dos explntes (30 minutos) proporcionou s menores txs de contminção, porém dnificrm os tecidos, provocndo escurecimento e necrose, resultndo n inibição do desenvolvimento e morte dos explntes. Resultdos semelhntes form observdos por Mores et l. (2007) estudndo desinfestção de gems xilres de bcxi submetids diferentes concentrções de hipoclorito de sódio e tempo de imersão. Em protocolo de micropropgção de Anns comosus, Teixeir et l. (2001) recomendm 0,5 1,0% de hipoclorito de sódio durnte minutos n obtenção de muds. Consttou-se no presente estudo que utilizção de ntibiótico no meio de cultur foi essencil pr o controle d contminção em explntes floris de cupuçu, permitindo o seu estbelecimento in vitro. Duhem et l. (1988), em estudos com cfé e ccu, observrm que presenç d ceftoxim sódic no meio de cultivo, promovi o controle d contminção, lém de não cusr efeito tóxico às plnts. Resultdos semelhntes form observdos por Rodrigues (2005), que

6 42 testou cefotxim e clornfenicol, isoldos e em combinção, pr o controle de microrgnismos endofíticos no estbelecimento in vitro de Heliconi rulinin, observndo que cefotxim plicd isoldmente, n concentrção de 500 mg.l -1 foi form mis eficiente de controle dos microrgnismos. Cost et l. (2007) verificrm que utilizção do ntibiótico cefotxim proporcionou um efeito positivo no controle do crescimento bcterino e sobrevivênci de explntes de lecrimpiment. 2 5 o vá r i o l íg u l e s t m i n ó d i op é t l 2 0 Porcentgens de contminção (%) T r t m e n to s d e d e s c o n t Figur 2. Porcentgens de contminção de explntes floris de cupuçu em meio com utilizção de ntibiótico, imersos em hipoclorito de sódio diferentes concentrções e períodos de imersão. Trtmento 5 0,25% de hipoclorito de sódio e 20 minutos de imersão; Trtmento 6-0,25% de hipoclorito de sódio e 30 minutos de imersão; Trtmento 7 0,50% de hipoclorito de sódio e 20 minutos de imersão; Trtmento 8 0,50% de hipoclorito de sódio e 30 minutos de imersão. Letrs diferentes indicm significânci 5%, pelo teste de Tukey. Porto Velho, Embrp Rondôni, CONCLUSÕES Recomend-se utilizção d menor concentrção de hipoclorito de sódio (0,25%) com 20 minutos de imersão dos explntes, o que uxili n redução d oxidção dos tecidos, pr descontminção de explntes floris de cupuçu. A dição de ntibiótico o meio de cultur torn-se necessári pr controlr contminção em explntes floris de cupuçu.

7 43 5. AGRADECIMENTOS Os utores grdecem o CNPq pelo poio finnceiro concedido este trblho trvés do projeto Desenvolvimento de biotecnologis pr o progrm de Melhormento do Cupuçuzeiro. 6. REFERÊNCIAS BUCKLEY, P.; De WILDE, T.; REED, B. Crcteriztion nd identifiction of bcteri isolted from micro propgted mint plnts. In Vitro Cellulr & Developmentl Biology, v.31, p , COSTA, A. S d; ARRIGONI-BLANK, M. F, BLANK, A. F; MENDONÇA, A. B de; AMÂNCIO, V. F; LEDO, A. d S. Estbelecimento de lecrim-piment in vitro. Horticultur Brsileir, v. 25, n. 1, p DUHEM, F.; MERCIER, N.; BOXUS, P. Difficulties in the estblishment of xenic in vitro cultures of field collected coffee nd cco germplsm. Act Horticulture, v. 225, p , GAMBORG, O. L.; PHILLIPS, G. C. Plnt cell, tissue nd orgn culture: fundmentl methods. Germny: Springer, p. GARCIA, E. V.; RAFAEL, M. Control de l oxidcion y contmincion em microesquejes de cfé (Coffe rbic Ctimor ) cultivdos in vitro. Agronomi Tropicl, v.40, p , GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropgção. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultur de tecidos e trnsformção genétic de plnts. Brsíli: EMBRAPA/CBAB, p LEIFERT, C.; RITCHIE, J. Y.; WAITES, W. M. Contminntes of plnt-tissue nd cell cultures. World Journl of Microbiology nd Biotechnology. v.7, p , MEDEIROS, C.P.C. de. Indução in vitro de resposts morfogenétics em explntes nodis de cjzeir (Spondis mombin L.) f. Dissertção (Mestrdo) Universidde Federl do Cerá, Fortlez. MONTARROYOS, A.V.V. Contminção in vitro. ABCTP Notícis, Brsíli, n.36 e 37, p.5-10, MORAES, A. M. de; ALMEIDA, F. A. C.; CAZÉ FILHO, J. Desinfestção e estbelecimento in vitro de gems xilres de bcxizeiro. Tecnologi & Ciênci Agropecuári, v.1. n.2, p MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A. A revised medium for rpid growth nd biossys with tissue cultures. Physiologi Plntrum, v. 15, p , PEREIRA, J. E. S.; MATTOS, M. L. T.; FORTES, G. R. de L. Identificção e controle com ntibióticos de bctéris endofítics contminntes em explntes de btt. Pesquis Agropecuári Brsileir, v. 38, n. 7, p , jul

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