MICROPROPAGAÇÃO DE GENGIBRE (Zingiber officinalle)

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1 MICROPROPAGAÇÃO DE GENGIBRE (Zingiber officinlle) MICROPROPAGATION OF GINGER (Zingiber officinlle) DEBIASI, Clyton ; FELTRIN, Fbin ; MICHELUZZI, Fernnd de C. RESUMO O cultivo do gengibre (Zingiber officinlle), executdo principlmente nos estdos do sul do Brsil, destc-se por destinr grnde prte de su produção o mercdo exterior. Um grnde problem d cultur está n produção de muds, que convencionlmente crret problems fitossnitários. Este trblho objetivou o desenvolvimento inicil de um protocolo de micropropgção de gengibre. Gems rizomtoss com proximdmente,5cm form submerss em soluções sséptics de hipoclorito de sódio % (, 5, e minutos) e de etnol 7%( e minutos), inoculds em meio de cultur MS e mntids 6±ºC, fotoperíodo de 6 hors 5 µmol m - s - por dis. Depois de obtido e dotdo o método sséptico, novs gems rizomtoss form estbelecids em meio de cultur MS, suplementdos com BAP ( e, mg L - ) e AIA ( e, mg L - ). A imersão ds gems por ou minutos em solução de hipoclorito de sódio % ssocid minutos em solução de álcool 7% inibiu contminção por microorgnismos. As médis do número de brotos emitidos os dis de cultivo indicrm o trtmento (. mg L - de BAP) como destque, com 4, novos brotos. Já em relção o tmnho ds brotções o destque foi pr o trtmento (sem suplementção de fitorreguldores), com crescimento médio de, cm de ltur. Plvrs-chve: Micropropgção, Zingiber officinlle, produção de muds, gems rizomtoss. INTRODUÇÃO A gm de espécies utilizds pr fins medicinis é significtivmente grnde e tendênci é que umente ind mis, já que s pesquiss e estudos relciondos este ssunto, crescem cd di ns instituições de ensino e pesquis, lém de hver um mobilizção mundil pr que se dote cd vez mis os medicmentos fitoterápicos. No presente trblho deu-se importânci o estudo do gengibre (Zingiber officinlle R.), um plnt originári d Ási Tropicl e do Arquipélgo Mlio que vem sendo cultivd mundilmente como monocultur e no Brsil, principlmente no Rio Grnde do Sul, Prná e Snt Ctrin, onde proximdmente 7% d produção destin-se exportção pr os píses como Holnd, Cndá, Alemnh e Estdos Unidos. Um dos grndes problems d cultur está relciondo à produção de muds com qulidde genétic e fitossnitári. Convencionlmente, os produtores propgm vegettivmente o gengibre, produzindo sus própris muds. Porém, est prátic crret vários problems fitossnitários, dentre eles disseminção de doençs cd ciclo d cultur, o que pode levr destruição totl ds plntções devido à disseminção rápid, principlmente de fungos (Fusrium oxysporium, Armillriell melle e Sclerotium rolfsii), nemtóides (Meloidogyne incognit e M. jvnic) e bctéris (Rlstoni solncerum, Erwini crotovor). Sendo ssim, o presente trblho objetivou inicir o desenvolvimento de um protocolo de micropropgção, trvés do estbelecimento in vitro de gems rizomtoss de Z. officinlle, possibilitndo produção mssl de muds de qulidde fitossnitári e genétic. MATERIAIS E MÉTODOS Os ensios experimentis form relizdos no Lbortório de Biotecnologi Micropropgção Vegetl do Deprtmento de Ciêncis Nturis d FURB. Pr os testes de ssepsi, gems rizomtoss de gengibre form coletds, reduzids o um tmnho inicil proximdo de,5-, cm e imerss em águ esterilizd. Em bncd de trblho e repetindo em câmr de fluxo lminr, form submetids diferentes combinções de tempos de imersão em soluções sséptics de hipoclorito de sódio % (, 5, e minutos) e de etnol 7%( e minutos), totlizndo sete trtmentos. Após o processo de ssepsi, s gems form inoculds em meio de cultur MS (MURASHIGE & SKOOG, 96) suplementdo com scrose ( g L - ), ágr (7, g L - ), ph justdo pr 5,8 e s culturs mntids em sl de crescimento 7±ºC, 6 hors de fotoperíodo 5 µmol m - s - de intensidde luminos por dis. Neste período form vlidos o percentul de gems não contminds e o percentul de contminção individulizdo conforme o tipo de gente contminnte. Nos testes de suplementção do meio de cultur MS com reguldores de crescimento, gems rizomtoss reduzids o tmnho d ª etp. Em seguid os explntes form reduzidos pr,5 cm e inoculds em meios de cultur MS com ph 5,8, suplementdos com scrose (), ágr (7, gl - ) e AIA ( e, mg L - ) ou BAP ( e, mg L - ), totlizndo trtmentos: T= MS, T=MS+,mg L - de AIA+, mg L - de BAP) e T (MS+, mg L - de BAP). As culturs form mntids ns mesms condições descrits nteriormente, permnecendo por dis, sendo vlidos, os 5 e dis de cultivo, o número médio de brotções induzids, ltur médi ds brotções induzids, o percentul totl de contminção, o percentul de contminção individulizd conforme o tipo de gente contminnte e o fenótipo ds plnts micropropgds. As plnts micropropgds form o finl do período de cultivo in vitro, climtds em potes plásticos contendo csc de Engº. Agrº. Doutorndo em Agronomi (Horticultur) pel FCA/UNESP/Botuctu-SP. Lbortório de Biotecnologi Micropropgção Vegetl, DCN/T-4, FURB, Cix Postl 57, 89-97, Blumenu-SC. Fone (47) -46. debisi@furb.br Biólog. Lbortório de Biotecnologi Micropropgção Vegetl, DCN/T-4, FURB, Cix Postl 57, 89-97, Blumenu-SC. vriegt@hotmil.com Acdêmic de Biologi e bolsist de inicição científic CNPq. Lbortório de Biotecnologi Micropropgção Vegetl, DCN/T-4, FURB, Cix Postl 57, 89-97, Blumenu-SC. nndmich@oktober.com.br (Recebido pr Publicção em 5/5/, Aprovdo em 5//4) R. brs. Agrociênci, v., n., p. 6-65, jn-mr, 4 6

2 DEBIASI et l. Micropropgção de Gengibre (Zingiber officinlle) rroz crbonizdo e rei (:), permnecendo em cs de vegetção por um período de 6 dis com redução solr de 5% e recebendo irrigções diáris por nebulizção. RESULTADOS E DISCUSSÃO Em relção os métodos diferenciis de ssepsi empregdos, form observds resposts diferenciis ds gems de gengibre estbelecids in vitro, vrindo conforme o tempo de imersão ns soluções sséptics de etnol 7% e hipoclorito de sódio %. Após dis de cultivo in vitro, pode-se notr superioridde d ssepsi ds gems nos trtmentos 5 ( minutos em hipoclorito de sódio % e minutos em álcool 7%) e 7 ( minutos em hipoclorito de sódio % e minutos em álcool 7%) em relção os demis. No que diz respeito os percentuis de gems não contminds, os trtmentos 5 e 7 presentrm % de gems não contminds, enqunto que o trtmento (nenhum imersão em soluções sséptics) ocorreu o inverso, isto é, % de gems comprometids pel presenç de gentes contminntes (Figur ). É constnte utilizção do hipoclorito de sódio, ns mis vrids concentrções, como form de ssepsi. Em processos de biotecnologi vegetl, s soluções de hipoclorito de sódio são mplmente empregds nos processos ssépticos ds fontes de explnte pr o estbelecimento inicil in vitro de um séri de espécies. SHARMA & SINGH (997) trblhrm com multiplicção mssl in vitro de gengibre, cultivr Himchl prdesh, visndo produção de muds isents de Fusrium oxysporum F., sp. zingiberi utilizrm gems rizomtoss com.5-. cm submetids ssepsi em solução de HgCl (.%) + gots de detergente Tween- por - minutos e lvgens em águ esterilizd, obtiverm 6% de sucesso n eliminção de gentes contminntes no estbelecimento inicil. Atulmente estes gentes descontminntes não estão mis sendo utilizdos devido contminção provocd pelo mercúrio o meio mbiente. Muitos form os gentes biológicos contminntes observdos nest etp do trblho, e mesmo não sendo relizds nálises de identificção individuis, pode-se observr ocorrênci de vários tipos de fungos e bctéris ssocidos às gems de gengibre inoculds in vitro. Como gentes de contminção, os fungos form observdos em mior quntidde qundo comprdos à ocorrênci de bctéris (Figur ). Os fungos observdos form principlmente dos tipos filmentosos (bolores), surgindo em grnde quntidde de esporos e lt diversidde de espécies, provenientes tnto de contminção endógen qunto exógen. Gerlmente cultivo in vitro de órgãos subterrâneos, é comum contminção por fungos e bctéris de origem endógen. Estes resultdos coincidem com os reltdos por SHARMA & SINGH (997) que, trblhndo com o estbelecimento in vitro de Gengibre, cultivr Himchl prdesh, reltrm ocorrênci de gentes contminntes dos tipos fungos e bctéris, com mior intensidde verificd pr o primeiro e em grnde vriedde. A suplementção do meio de cultur MS com reguldores de crescimento, mostrou resposts diferenciis ds gems de Gengibre estbelecids in vitro, vrindo conforme o tipo, concentrção, combinção ou mesmo n usênci destes (figur ). No que diz respeito o número médio de brotções emitids os 5 dis de cultivo, não form observds diferençs esttístics significtivs entre os trtmentos plicdos, porém o destque ficou por cont do trtmento (MS isento de suplementção com fitorreguldores), o qul induziu um médi de, novos brotos cd gem inoculd. % Figur - Índices percentuis totis de gems rizomtoss de Gengibre (Zingiber officinlle R.), isents de contminção, cultivdos em meio de cultur MS pós dis in vitro, submetids diferentes trtmentos ssépticos: T; T (5 minutos em hipoclorito de sódio %); T(5 minutos em hipoclorito de sódio % + minutos em etnol 7%); T4( minutos em hipoclorito de sódio %); T5( minutos em hipoclorito de sódio % + minutos em etnol 7%); T6( minutos em hipoclorito de sódio %); T7( minutos em hipoclorito de sódio % + minutos em etnol 7%). (N=) % Trt Trt Trt Trt 4 Trt 5 Trt 6 Trt 7 Trtmentos Trt Trt Trt Trt 4 Trt 5 Trt 6 Trt 7 Trtmentos Fungos Bctéris Figur - Índices percentuis de contminção, dos tipos fungos e bctéris, em gems de Gengibre cultivds em meio MS de cultur pós dis in vitro, submetids diferentes trtmentos ssépticos: T; T (5 minutos em hipoclorito de sódio %); T(5 minutos em hipoclorito de sódio % + minutos em etnol 7%); T4( minutos em hipoclorito de sódio %); T5( minutos em hipoclorito de sódio % + minutos em etnol 7%); T6( minutos em hipoclorito de sódio %); T7( minutos em hipoclorito de sódio % + minutos em etnol 7%). (N=) Referente o tmnho médio ds brotções, verificou-se igulmente não existênci de diferenç esttístic significtiv entre os trtmentos plicdos e o destque 6 R. brs. Agrociênci, v., n., p. 6-65, jn-mr, 4

3 DEBIASI et l. Micropropgção de Gengibre (Zingiber officinlle) novmente pr o trtmento (MS isento de suplementção fitorreguldores), com tmnho médio de brotos de,6 cm de ltur. Aos dis de cultivo os resultdos referentes às médis do número de brotções mostrm que os trtmentos não diferirm esttisticmente entre si, porém o trtmento (MS+. mg L - de BAP) se sobressiu em relção os demis, com indução médi de 4, novos brotos. Já os trtmentos (MS isento de suplementção com fitorreguldores) e (MS+. mg L - de BAP+. mg L - de AIA), presentrm médis de 4,4 e,87 novos brotos emitidos por gem inoculd, respectivmente, pós os dis de cultivo in vitro (Figur ). A 4,5 4,5,5,5,5 B Nº de brotos Comprimento dos brotos (cm),5,5,5,5 T T T Trtmentos 5 dis dis Figur - Número médio (A) e comprimento médio (B) de brotos de Gengibre (Zingibre officinlle) emitidos por explntes iniciis referentes os 5 e dis de cultivo in vitro nos diferentes trtmentos (T=MS, T=MS+,mg L - de AIA+,mg L - de BAP e T=MS+,mg L - de BAP). Médis seguids d mesm letr não diferem esttisticmente entre si pelo teste Tukey 5%. (N=) N Figur 4 podemos observr os efeitos dos trtmentos n pdronizção morfogenétic d respost in vitro ds gems rizomtoss de gengibre, onde podemos notr o efeito mrcnte do trtmento isento de reguldores de crescimento. ARIMURA et l. () suplementrm o meio MS com,5 mg L - de ANA+,5 mg L - de BAP e obtiverm médi de,9 brotos como o melhor resultdo no estbelecimento in vitro de gems de Gengibre. SHARMA & SINGH (997), cultivrm gems de Gengibre, cultivr Himchl prdesh, em meio de cultur MS suplementdo com os fitorreguldores BAP ou KIN (Cinetin)+AIA, AIB (Ácido Indól-Butírico) ou ANA (Ácido Nftleno-Acético) e os resultdos mostrrm que suplementção isold do meio de cultur MS com 8 mg/l de KIN induziu um médi de 4, novos brotos e suplementção combind com mg L - de KIN+ mg L - de AIB, induziu um médi de 7 brotos. Aind HOSOKI & SAGAWA (977) conseguirm trvés d micropropgção do b b gengibre, um médi prolifertiv de 6 novos brotos por explnte inicil. As txs médis prolifertivs obtids neste trblho estão muito próxims àquels obtids por BALACHANDRAN et l. (99), os quis trblhndo com gems in vitro de gengibre obtiverm médi de 4 novos brotos por explnte, pós 4 semns, utilizndo o meio MS+ mg L - de BAP. A formção de gems lteris é um processo de orgnogênese diret comnddo pel dominânci picl, n presenç de um blnço AIA/Citocinins fvorável s Citocinins (TAIZ & ZEIGER, 4) e segundo DEBIASI (), spectos relciondos o controle do desenvolvimento dests gems vem sendo mplmente estuddos e reltdos nos últimos nos, enftizndo o efeito dos reguldores de crescimento, d luz, d vsculrizção e dos nutrientes. A interção destes ftores pode ser um dos pontos pr se explicr às diferençs n cpcidde de multiplicção e desenvolvimento ds gems rizomtoss do gengibre neste trblho. T T T Figur 4 - Efeitos dos trtmentos (T=MS, T=MS+, mg L - de AIA+, mg L - de BAP e T=MS+, mg L - de BAP) plicdos sobre o pdrão comportmentl morfogenético de gems rizomtoss de Zingiber officinlle R. pós dis de cultivo in vitro. A ltur médi ds brotções, os dis de cultivo in vitro, mostrou diferenç esttístic significtiv entre os trtmentos plicdos, onde o destque foi pr o trtmento (MS isento de suplementção com reguldores de crescimento), induzindo um crescimento médio ds brotções de, cm de ltur. DEBIASI (), depois de observções relizds n micropropgção d bnneir, relt que ltur médi ds brotções micropropgds é inversmente proporcionl à tx prolifertiv, ou sej, qunto mior ltur médi, menor será o número médio de brotos formdos. Est informção é confirmd neste trblho, já que s miores médis em ltur dos novos brotos emitidos form verificds no meio de cultur MS isento d suplementção com os reguldores de crescimento, com menores txs prolifertivs. Já INDEN & ASAHIRA (988), tmbém trblhndo com o R. brs. Agrociênci, v., n., p. 6-65, jn-mr, 4 6

4 DEBIASI et l. Micropropgção de Gengibre (Zingiber officinlle) gengibre, obtiverm mior tmnho de brotos (,4 cm) em meio MS contendo combinções semelhntes de ANA e BAP. Já o trtmento (MS+. mg L - de BAP) e o trtmento (MS+. mg L - de BAP+. mg L - de AIA), presentrm lturs médis de,9 e, cm respectivmente pr os novos brotos emitidos, sendo significtivmente menores que os tmnhos notdos no trtmento (MS isento de reguldor de crescimento). ARIMURA et l () comprovou que utilizção combind de,69 um de ANA e 8,88 um de BAP n suplementção do meio de cultur MS, induziu igulmente os menores comprimentos de brotções de gengibre pós 6 dis de cultivo. A diferenç observd ns vlições relizds entre os intervlos de 5 e dis de cultivo in vitro, demonstrou o umento expressivo no longmento ds plnts, principlmente no trtmento (MS isento de reguldor de crescimento), ficndo evidente que não existe, pr est espécie, nenhum ftor de efeito direto do BAP e AIA, plicdo de form exógen, em estimulr o crescimento ds brotções e sim n indução dests. Dess form, dição de BAP (, mg L - ) o meio de cultur MS (trtmento ), proporcionou umento n tx prolifertiv, porém com ltur reduzid. Estes resultdos não são semelhntes pr tods s espécies cultivds in vitro, já que existem reltos contrrindo este pdrão. BIASE (99) e PINTO et l. (994) trblhrm com multiplicção in vitro de bcteiro e de Kielmeyer corice, respectivmente, e encontrrm brotos miores em meios de cultur suplementdos com reguldores de crescimento, do que em meios isentos destes reguldores. As vlições relizds neste trblho, referentes s possíveis lterções fenotípics ds plnts micropropgds de gengibre, demonstrrm não ocorrênci de qulquer tipo de normlidde medinte plicção d metodologi descrit. A utilizção no presente trblho de gems rizomtoss como explnte inicil, suplementção do meio de cultur MS com pens, mg L - de BAP e AIA, e relizção de pens um subcultivo, tlvez tenhm sido os motivos que explicm não ocorrênci de vrintes somclonis, já que existem conceitos e referêncis que reltm ests possibiliddes. Pr SMITH (988) e ZAFFARI et l. (995), s lterções genétics induzids n micropropgção serim influencids pelo tipo do explnte, pel composição do meio de cultur, pelo número de subcultivos e pelo nível orgnizcionl do tecido. D'AMATO (978) levnt hipótese de que s céluls meristemátics serim s únics mnter estbilidde genétic em um vegetl. Segundo DEBIASI (), o emprego de meristems picis e lteris proporcion índices reltivmente bixos de vrição somclonl e tribui-se o blnço endógeno de uxin e citocinin um dos principis ftores responsáveis pel determinção do tipo de gem que irá se originr. Segundo ORELLANA et l. (99), o emprego de concentrções de citocinins n fix de, 5, mg L - tmbém minimiz o precimento de plnts mutntes produzids in vitro e PINTO et l. (994) trblhndo com segmentos nodis de Kielmeyer corice cultivdos em meio de cultur MS suplementdo com concentrções cim de 8, mg L - de BAP, observrm formção de brotções normis. ISRAELI et l. (99) reltm que o emprego de té seis subcultivos pr micropropgção d bnneir, result em txs percentuis de vrintes somclonis que não ultrpssm os 5%. Outro ponto se destcr neste trblho diz respeito o rápido desenvolvimento morfogenético ds gems rizomtoss de gengibre cultivds in vitro. O estbelecimento de um plnt complet se deu em médi com proximdmente dis de cultivo pr formção de folhs e rízes. Este comportmento demonstr que o gengibre é um espécie que possui lto poder regenertivo e tmbém prolifertivo qundo cultivdo in vitro. Bsedo nos reltos de SHARMA & SINGH (997), os quis eliminrm com sucesso o Fusrium oxysporum F. sp. Zingiberi trvés do estbelecimento d micropropgção do gengibre, cultivr Himchl prdesh, e tmbém DE LANG et l. (987) que eliminrm nemtóides trvés d produção de muds de gengibre vi micropropgção, tenttivmente pode-se firmr que com metodologi utilizd neste trblho possivelmente resultrá n produção de muds isents de qulquer tipo de gente ptogênico, principlmente dqueles que comumente se encontrm ns muds convencionlmente produzids (fungos, nemtóides e bctéris). Outr possibilidde que se pode levntr, bsedo em SHARMA & SINGH (997), os quis descrevem que tx prolifertiv médi do gengibre, cultivr Himchl prdesh se mnteve por 8 meses, é que este potencil tmbém sej refletido no mteril vegetl trblhdo neste experimento. Se ssim ocorrer, supõe-se que, mntendo tx prolifertiv médi de 4, novos brotos cd dis de cultivo em meio de cultur MS+. mg L - de BAP (trtmento ), tingir-se-á, o finl de no, cerc de 5.5. muds micropropgds de gengibre. Em relção à climtção ds muds micropropgds de gengibre, observmos que metodologi propost foi eficiente nest etp d protocolção, um vez que o índice percentul de perd n climtção não ultrpssou os 5%. Trtndo-se de reltos in vitro com o gengibre, podemos encontrr respldos comprtivos pr este trblho em BHAGYALAKSHMI & SINGH (988), WANG (989), BALACHANDRAN et l. (99) e MALAMUG et l. (99), que trblhrm com orgnogênese, BABU et l. (99) e KACKAR et l. (99) com embriogênese somátic, DEKKERS et l. (99) descrevendo metodologis de conservção de germoplsm, SHARMA et l. (994) com produção de microbrotos encpsuldos/sementes sintétics e SHARMA & SINGH (997) reltndo produção de microrizoms. CONCLUSÕES O estbelecimento de um protocolo de produção mssl de muds de gengibre com lt qulidde genétic e fitossnitári trvés de métodos biotecnológicos de micropropgção vegetl é totlmente viável e possível; A imersão de gems rizomtoss de gengibre em solução de hipoclorito de sódio % por minutos e de etnol 7% por minutos, repetindo est operção em bncd de trblho e em câmr de fluxo lminr, proporcion um percentul de % n eliminção de gentes contminntes in vitro; A utilizção do meio de cultur MS isento d suplementção com reguldores de crescimento, proporcion um ótim condição pr o estbelecimento inicil de gems rizomtoss de gengibre qundo cultivds in vitro. A climtção de gengibre em substrto de csc de rroz crbonizd e rei (:), sob redução solr de 5%, por um período de 6 dis, proporcion ótim condição de préestbelecimento cmpo ds muds micropropgds. 64 R. brs. Agrociênci, v., n., p. 6-65, jn-mr, 4

5 DEBIASI et l. Micropropgção de Gengibre (Zingiber officinlle) AGRADECIMENTOS Os utores expressm seus grdecimentos o CNPq (Conselho Ncionl de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e FURB (Universidde Regionl de Blumenu) pelo poio finnceiro o trblho. ABSTRACT Cultivtion of ginger (Zingiber officinlle) grown minly in the sttes of southen Brzil, is distinguished for destining big portion of its production to the exterior mrket. The mjor problem of the culture is the production of plntlets due to pthologicl problems. The objective of this work ws to develop n initil protocol for micropropgtion of ginger. Buds from the rhizomes with pproximtely,5 cm were submerged in septic solutions of sodium hypoclorite %(, 5, nd minutes) nd ethnol 7%( nd minutes) nd inoculted in MS medin nd kept t 6±ºC, photoperiod of 6 hours, 5 µmol m - s - for dys. After obtining nd dopting the septic method, new roots buds hd been estblished in the sme MS medium nd supplemented with BAP ( nd, mg L - ) nd IAA ( nd, mg L - ). The immersion of rhizome buds for or minutes in solution of sodium hypoclorite % combined with the minutes in lcohol solution 7% did not show contmintion by microorgnisms. The highest verge number of sprouts emitted fter dys of culture ws obtined supplementing the medi with. mg.l - of BAP producing 4. new sprouts. In reltion to the size of the sprouts, medi out with growth regultors, produced n verge growth of. cm of height. Key words: Micropropggtion; Zingiber officinlle, production of plnts, roots buds. REFERÊNCIAS ARIMURA, C.T.; FINGER, F.L.; TEIXEIRA, J.B. Interção ANA x BAP no desenvolvimento in vitro de gengibre. Act Horticulture, v.569, p.89-9,. BABU K. N.; SAMASUDEEN K.; RATNAMBAl M. J. In vitro plnt regenertion from lef derived cllus in ginger (Zingiber officinlle Rosc.). 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