CULTIVO IN VITRO DE FOLHAS DE ERVA-MATE VISANDO ENRAIZAMENTO E CALOGÊNESE 1

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1 CULTIVO IN VITRO DE FOLHAS DE ERVA-MATE VISANDO ENRAIZAMENTO E CALOGÊNESE 1 COMIRAN, Mrine 2 ; QUADROS, Keni Michele de 3 ; BISOGNIN, Dilson Antônio 4 ; FISCHER, Hrdi 5 ; RAUBER, Mrcelo 6 ; PIMENTEL, Ntháli 7 1 Trblho de Pesquis _UFSM 2 Grdundo em Agronomi, Universidde Federl de Snt Mri UFSM, Snt Mri, Brsil. 3 Engenheir Florestl, Doutornd em Engenhri Florestl, Universidde Federl de Snt Mri - UFSM, Snt Mri, Brsil. 4 Engenheiro Agrônomo, Ph.D., Professor Titulr do Deprtmento de Fitotecni, Universidde Federl de Snt Mri - UFSM, Snt Mri, Brsil 5 Grdundo em Agronomi, Universidde Federl de Snt Mri UFSM, Snt Mri, Brsil 6 Grdundo em Engenhri Florestl, Universidde Federl de Snt Mri, Snt Mri, Brsil 7 Grdundo em Engenhri Florestl, Universidde Federl de Snt Mri, Snt Mri, Brsil E-mil: mrinecomirn@hotmil.com, nb.nne@hotmil.com RESUMO O objetivo deste trblho foi cultivr in vitro folhs de erv-mte mntids in vitro, visndo o enrizmento e clogênese dests, umentndo utilizção de tecidos de explntes seleciondos e evitndo o descrte de mteril. Form cultivds folhs de três genótipos seleciondos de erv-mte, em meio de cultur MS com diferentes combinções de concentrções de BAP mis AIB. Houve diferenç entre os nove trtmentos testdos. A porcentgem de mortlidde do experimento foi bix, porcentgem de enrizmento foi lt e formção de clos nos explntes foi vriável. Esses resultdos indicm que o tecido está ltmente rejuvenescido e que estes genótipos estuddos possuem lt cpcidde pr orgnogênese diret prtir d cultur de folhs in vitro. Plvrs-chve: Cultur de tecidos; rejuvenescimento de tecidos, cultur de embriões. 1. INTRODUÇÃO A erv-mte (Ilex prguriensis Sint Hilire.) é um espécie rbóre endêmic do Continente Americno, ocupndo km 2, dos quis, km 2 estão no Brsil, nos estdos do Rio Grnde do Sul, Snt Ctrin, Prná e sul do Mto Grosso do Sul (DA CROCE et l., 1994). Est espécie tem grnde importânci socioeconômic podendo ser utilizd n produção de bebids estimulntes, medicmentos, corntes, lém de ter importânci mbientl, pois reliz consórcio com outrs plnts, mntendo um equilíbrio do ecossistem. Contudo su expnsão present lgums limitções qundo em virtude d 1

2 su propgção por sementes, pois ests sementes possuem dormênci tegumentr e embrionári e presentm bix qulidde genétic e fisiológic, dificultndo o mnejo d cultur (STURION, 1988; SAND, 1989; FOWLER e STURION, 2000). Os problems cim citdos podem ser reduzidos por meio d obtenção de muds por propgção vegettiv de indivíduos geneticmente superiores possibilitndo gnhos genéticos, uniformidde, mior produtividde (WENDLING, 2004). Por meio d propgção vegettiv mssl é possível se obter vários novos indivíduos completos (clones) por intermédio de certs estruturs vegettivs sendo que tods s crcterístics genétics d plnt mtriz são trnsferids pr nov plnt. Pr que se poss relizr propgção clonl mssl são seleciondos pens os genótipos superiores, sendo ess superioridde genétic dos indivíduos fenotipicmente seleciondos comprovd por meio de su multiplicção (WENDLING, 2004). A técnic d propgção vegettiv pode ocsionr perd d cpcidde morfogênic dos tecidos clondos, devido á mturidde fisiológic dos clones serem idênticos à d plnt-mtriz d qul foi destcdo (THORPE et l.,1991). Contudo, com técnic de cultur in vitro de tecidos, devido o rejuvenescimento de tecidos tingido, podem-se reproduzir espécies lenhoss reclcitrntes o enrizmento, lém de possibilitr obtenção de um grnde número de plnts com crcterístocs selecionds trvés de poucs mtrizes em curto espço de tempo e em reduzid áre de lbortório (PAIVA e GOMES, 1995). Os segmentos nodis e folhs são ótims fontes de explntes por permitirem regenerção de plnts devido o lto gru de tividde meristemátic destes (MURASHIGE e SKOOG, 1977), sendo ests céluls especilizds cpzes de inicir formção de órgãos como rízes e brotos (GEORGE et l., 2008). Pr relizção d técnic d microestqui, ápices ou segmentos nodis in vitro, com um ou dus folhs cortds pel metde, são utilizdos, descrtndo-se o tecido folir restnte. No entnto este mteril descrtdo está em condições sséptics e potencilmente rejuvenescido. 2

3 Dinte do exposto, o objetivo deste trblho foi cultivr in vitro folhs de explntes de genótipos seleciondos de erv-mte mntidos in vitro, visndo o enrizmento e clogênese dests, umentndo dest mneir o uso dos propágulos in vitro e evitndo o descrte de mteril em potencil, testndo diferentes combinções de BAP (benzilminopurin) e AIB (ácido indol-butírico). 2. METODOLOGIA O experimento foi conduzido no Núcleo de Melhormento e Propgção Vegettiv de Plnts do Deprtmento de Fitotecni d Universidde Federl de Snt Mri, RS. As folhs utilizds pr o experimento são oriunds de plântuls formds prtir embriões zigóticos de sementes excisds (HORBACH et l., 2011). Em câmr de fluxo lminr, no momento d confecção d pdronizção ds microestcs (QUADROS et l., 2011), s folhs que serim descrtds pr microestqui, form coletds e introduzids in vitro. Selecionrm-se três genótipos pr este experimento. Os trtmentos consistirm de combinções de concentrções de BAP mis AIB (Qudro 1) em meio de cultur ¼ de MS (MURASHIGE E SKOOG, 1962), com 30 g.l -1 de scrose e 7 g.l -1 de ágr, com ph justdo pr 5,7 com HCl e NOH. Concentrções Trtmentos BAP (mg.l -1 ) AIB (mg.l -1 ) , Qudro 1 Trtmentos utilizdos: diferentes concentrções de BAP com AIB no cultivo in vitro de folhs de erv-mte. Snt Mri, RS. Os frscos utilizdos do experimento tinhm cpcidde pr 150 ml e continhm 20 ml de meio de cultur ¼ de MS com 30 g.l -1 de scrose e 7 g.l -1 de ágr mis seus respectivos trtmentos, onde form inseridos qutro folhs em cd frsco. 3

4 Posteriormente, os frscos form fechdos, com ppel lumínio duplo, e mntidos em sl de cultivo com tempertur de 25 ± 2 ºC, fotoperíodo de 16 h, sob intensidde luminos de 14,3 µe m -2 S -1 fornecids por lâmpds fluorescentes. Nos primeiros 15 dis, s folhs permnecerm sob escuro totl, e os 15 dis restntes sob luminosidde norml d sl de cultivo. A vlição ocorreu 30 dis pós o estbelecimento in vitro e form contbilizds porcentgem de enrizmento e mortlidde lém de ser tribuído clsses de vlores que vrim de 0 3 pr formção de clos (Qudro 2). Formção de clo Vlor tribuído Nenhum formção de clo 0 Até 25 % d folh com clo 1 Até 50% d folh com clo 2 Mis de 50% de clo n folh 3 Qudro 2 Clsses tribuíds pr formção de clo ns folhs in vitro de erv-mte. Form utilizds 180 folhs de plnts cultivds in vitro, dividids em nove trtmentos, de cinco repetições com qutro folhs cd. O delinemento experimentl utilizdo foi o inteirmente csulizdo, os ddos form submetidos à nálise d vriânci e s médis form comprds por teste de Tukey, com 5% de probbilidde de erro, com o uxílio do progrm Sttisticl Pckge for the Socil Sciences (SPSS) 7.5 pr Windows (SPSS Inc. Chicgo II). 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES N vlição os 30 dis, observou-se que em todos os trtmentos estuddos, porcentgem de mortlidde foi bix (Figur 1), não presentndo diferenç esttístic. A porcentgem de enrizmento diferiu entre os trtmentos, com porcentgens bixs no trtmento 1 e nulo no trtmento 3. Nos demis trtmentos, porcentgem de enrizmento não foi muito vriável e o trtmento 5 presentou 100 % ds folhs enrizds. A formção de clo médi, que foi vlid por meio de clsses (Qudro 2), vriou de 0,5 2,5 e pens o trtmento 3 não presentou formção de clo. A mior formção de clo ocorreu no trtmento 1, seguido dos trtmentos 4 e 5. 4

5 Folhs Mortlidde e enrizmento (%) b bc bc * bc c Trtmentos b Mortlidde Enrizmento b bc A Formção de clo (médi) B Folhs 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 clo bc b bc bcd bcd bc cd d Trtmentos *Médis seguids de mesm letr não diferem entre si pelo teste de Tukey, 5 % de probbilidde de erro. Figur 1- Cultur de folhs de três genótipos de erv-mte os 30 dis utilizndo combinções de diferentes concentrções de BAP mis AIB: A Porcentgens de mortlidde e enrizmento; B Médi de formção de clo. Os trtmentos 4 e 5 presentrm índices de mortlidde nulos. O trtmento 5 pode ter presentdo mior porcentgem de enrizmento devido à mior concentrção de AIB. Todvi, deve-se tentr o fto de que o umento ds concentrções não necessrimente ument s porcentgens de enrizmento, pois em excesso esse hormônio pode cusr fitotoxidez, reduzindo o enrizmento. Pr qulquer tipo de respost induzid pels uxins, existe um concentrção ótim, lém d qul, els pssm exercer inicilmente um efeito inibitório e depois um efeito tóxico (DEVLIN, 1982). 5

6 Os trtmentos não presentrm diferençs significtivs n porcentgem de mortlidde, todvi, inferiu-se que o trtmento que obteve menor tx de sobrevivênci foi o trtmento 9, que possuí s lts concentrções tnto de uxins (AIB) qunto de citocinins (BAP). O lto poder de toxidez, nesss condições, pode ter sido um dos motivos d bix tx de sobrevivênci. Observou-se que, dos clos formdos, 25% dos clos erm friáveis, ou sej, possuí crcterístics diferentes, como colorção brnc, opcidde cert grnulometri. Segundo Skoog e Miller (1957), pr cultur de clos, utilizção de uxins e citocinins no meio de cultur utilizdo no cultivo in vitro tende ser benéfic qundo em quntiddes dequds e equilibrds. Como demonstrdo neste experimento, o BAP sozinho não tem cpcidde de induzir formção de clos nem o enrizmento, o contrrio do AIB. Neste estudo com folhs de erv-mte in vitro, pode-se observr que o BAP não estimul o enrizmento e formção de clos. Além disto, combinções de lts concentrções de BAP com AIB diminuírm s porcentgens de enrizmento e de formção de clo e umentrm porcentgem de mortlidde. No entnto o uso de AIB é necessário, sendo que s miores concentrções utilizds (5 mg/l) foi eficiente pr o enrizmento e formção de clo ns folhs. 4. CONCLUSÃO É possível cultivr folhs de erv-mte in vitro visndo o enrizmento e formção de clos. Não é necessário crescentr o BAP o meio de cultur pr indução de rízes e clos em folhs de erv-mte, no entnto, o AIB é necessário, sendo que concentrção de 5 mg/l crescido o meio de cultur ¼ de MS é eficiente. REFERÊNCIAS DA CROCE, D. M.; HIGA, A. R.; FLOSS, P. A. Escolh de fontes de sementes de erv-mte (Ilex prguriensis St.Hil.) pr Snt Ctrin. Florinópolis : EPAGRI, p. (EPAGRI. Boletim Técnico, 69). DEVLIN. Fisiologi Vegetl. Editoril Pueblo y Educción. L Hbn, 1982, 400 p. 6

7 FOWLER, J. A. P.; STURION, J. A. Aspectos d formção do fruto e d semente n germinção d erv-mte. Colombo: Embrp Florests, p. (Embrp Florests. Comunicdo Técnico, 45). GEORGE, E. F.; HALL, M. A.; KLERK, G. D. Plnt Propgtion by Tissue Culture. Netherlnds p. HORBACH, M. A. et l. Micropropgção de plântuls de erv-mte obtids de embriões zigóticos. Ciênci Rurl, Snt Mri, v.41, n.1, p , MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rpid growth nd biossys with tobcco tissue culture. Physiologi Plntrum, v. 15, p , MURASHIGE, T.; SKOOG, F. Mnipultion of orgn initition in plnt tissue cultures. Bot. Bull. Acdemi Sinic, v. 18, p.1-24, PAIVA, H. N.; GOMES, J. M. Propgção vegettiv de espécies florestis. Viços: UFV, MG, p. (Boletim, 332). QUADROS, K. M. et l. Aclimtizção e enrizmento ex vitro de microestcs juvenis de erv-mte. In: 5 CONGRESSO SUDAMERICANO DE LA YERBA MATE, 2011, Argentin. Anis...Posds, Instituto Ncionl de l Yerb Mte; Universidd Ncionl de Missiones, 2011, p SAND, H. A. Propgción gmic de l yerb mte (Ilex prguriensis St. Hil.). Not Técnic n. 40, INTA, Misiones, 1989, 11 p. SKOOG, F.; MILLER, C. O. Chemicl regultion of growth nd orgn formtion in plnt tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol., v. 11, p , STURION, J. A. Produção de muds e implntção de povomentos com erv-mte. Curitib, EMBRAPA-CNPF, p (Circulr Técnic, 17). THORPE, T. A.; HARRY, I. S.; KUMAR, P. P. Appliction of micropropgtion to forestry. In: DEBERGH, P. C.; ZIMMERMAN, R. H. Micropropgtion: technology nd pliction. Dordrecht: Kluwer Acdemic Press, p

8 WENDLING, I. Propgção vegettiv de erv-mte (Ilex prguriensis Sint Hilire): estdo d rte e tendêncis futurs. Colombo: Embrp Florests, 46 p (Embrp Florests. Documentos, 91). 8