INFLUÊNCIA DOS FATORES FÍSICOS NA REGENERAÇÃO DE BROTOS EM REPOLHO INFLUENCE OF PHYSICAL FACTORS ON SHOOT REGENERATION OF CABBAGE

Transcrição

1 INFLUÊNCIA DOS FATORES FÍSICOS NA REGENERAÇÃO DE BROTOS EM REPOLHO CLÓVIS MAURÍLIO DE SOUZA 1 JOSÉ EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO 2 BENEDITA MARIA RODRIGUES 3 AUGUSTO RAMALHO DE MORAIS 4 MARIA DE FÁTIMA ARRIGONI-BLANK 5 RESUMO - Os ftores físicos, meio de cultur e tipo de tmp, form utilizdos pr regenerção de brotos de repolho (Brssic olerce L. vr. cpitt L.). Os explntes form inoculdos em meio sólido e líquido de Murshige e Skoog (MS) modificdo. No segundo experimento, form utilizdos três tipos de tmps: metl, vitfilme e plástic. Independentemente d consistênci do meio sólido ou liquido, ocorreu regenerção de brotos. Não houve efeito significtivo do tipo de tmp n regenerção de brotos. TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Tipo de tmp, meio de cultur, Brssic olerce, repolho INFLUENCE OF PHYSICAL FACTORS ON SHOOT REGENERATION OF CABBAGE ABSTRACT - The physicl fctors s medium consistency nd cp type were used to optimize shoot regenertion of cbbge (Brssic olerce L. vr. cpitt L.). The explnts were cultured on modified Murshige nd Skoog (MS) solid nd INEDX TERMS: Cp type, medium consistency, Brssic olerce. liquid mediums. In nother ssy, three types of cps (metl, vitfilm nd plstic) were used. Independent of medium consistency type shoot regenertion occurred. The cp type hd no significnt effect on shoot regenertion. INTRODUÇÃO O estbelecimento e multiplicção de um determind espécie vegetl in vitro estão sujeitos à influênci de diversos ftores, e combinção dequd de todos esses ftores proporcion o sucesso d propgção pr cd espécie. As concentrções dos sis e dos reguldores de crescimento nos meios de cultur, bem como tempertur e fotoperíodo, são os ftores que mis vrim entre s espécies micropropgds. Outros ftores, como utilizção de gentes geleificntes dos meios de cultur e os tipos de tmps empregds no fechmento dos frscos, podem influencir o desenvolvimento de lgums culturs. A inicição d cultur in vitro de bromélis ocorre mis fcilmente qundo se utiliz meio de cultur líquido, isso tem sido verificdo, tmbém, pr orquíde. A cultur de brotos picis de sprgos e gérber requerem pr su inicição meio semi-sólido (Murshige, 1974). O ágr, lém do efeito no potencil mátrico do meio de cultivo, lterndo disponibilidde de águ, nutrientes e fitoreguldores, pode modificr composição químic do meio, conforme o teor de impurezs (Grttpgli e Mchdo, 1990). Romberger e Tbor (1971) reltrm que o crescimento de brotos de Pice bies Link foi significtivmente influencido pel qulidde do ágr. D mesm form, Singh (1982) relt que presenç de inibidores no ágr fet proliferção de brotos. É possível que s concentrções ótims de sis, num meio sólido, sejm mis elevds do que s concentrções ótims pr o crescimento em meio líquido, devido às restrições n velocidde de difusão de nutrientes que o meio sólido impõe (Clds, Hridsn e Ferreir, 1990). 1. Engenheiro Agrônomo, MS, Deprtmento de Agricultur, UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS/UFLA 2. Engenheiro Agrônomo, PhD, Deprtmento de Agricultur/ UFLA, Cix Postl 37, Lvrs MG. 3. Biólog, MS, Seção de Genétic do IAC, Cix Postl Cmpins SP. 4. Engenheiro Agrônomo, Dr., Deprtmento de Ciêncis Exts/ UFLA. 5. Biólog, MS, Bolsist RHAE/CNPq. DAG/UFLA.

2 831 Embor economicmente interessnte, utilizção de meio líquido present, freqüentemente, plnts com specto vitrificdo. Snir e Erez (1980) tribuem esse fto possivelmente mior bsorção de nutrientes e hormônios do meio, não pens trvés d bse cortd do explnte, ms de tod su superfície. Grttpgli e Mchdo (1990) firmm que um ds medids dotds pr conter esse processo degenertivo é justmente o incremento n concentrção de ágr no meio de cultur. Psquleto, Zimmermn e Fordhm (1986) verificrm decréscimo significtivo n percentgem de plnts vitrificds de mcieir, com o umento n concentrção de ágr no meio. Entretnto, elevção n concentrção de ágr pode resultr em um meio muito consistente que, embor sej útil pr evitr vitrificção, provoc inibição no desenvolvimento d plnt, reduzindo tx de multiplicção (Murshige, 1974; Grttpgli e Mchdo,1990). Qunto às tmps utilizds pr vedr os frscos, sbe-se que tmbém exercem efeito no desenvolvimento de lguns explntes. Esse efeito é devido, principlmente, à formção de microclim dentro do frsco (Grttpgli e Mchdo,1990). As tmps de plástico (polipropileno) são s mis utilizds nos lbortórios, porque são desenvolvids especilmente pr trblhos em cultur de tecidos e resistem elevds temperturs, podendo ser utoclvds sem deformção. Porém, o elevdo custo contribui pr utilizção de outros tipos de tmps, como: ppel de lumínio, lgodão, metl e vitfilme R (PVC) (Pierik, 1987) A utilizção de vitfilme R permite mior penetrção d luz qundo comprd os outros tipos de tmps. Além disso, ocorre mis rpidmente perd de águ no interior do frsco, cusndo menor disponibilidde de águ n form gsos, prevenindo vitrificção e estimulndo trnspirção ns plnts, e evitndo s necroses picis por deficiênci de elementos pouco trnslocáveis como o cálcio. Os frscos devem ser bem fechdos pr evitr o ressecmento e contminção por gentes externos; por outro ldo, s tmps devem permitir troc gsos com o mbiente externo, evitndo que ocorr deficiênci de O 2 e cúmulo de gses como CO 2 e etileno (Pierik, 1987). Neste sentido, o objetivo do trblho foi vlir influênci d consistênci do meio de cultur e os três tipos de tmps sobre o desenvolvimento de segmentos nodis de repolho (Brssic olerce L. vr. cpitt L.) in vitro. MATERIAL E MÉTODOS Os explntes utilizdos form microestcs de repolho do clone 400 e d fmíli clonl-800 obtids do cultivo in vitro, que form seccionds em segmentos de 2,5 cm de comprimento com 4 5 gems xilres. Pr o experimento 1, form colocdos em tubos de ensio (25 x 150 mm) contendo 15 ml de meio de cultur MS, suplementdo com denin (27 mg/l), AIA (5 mg/l), fosfto monobásico de sódio (161,5 mg/l) e Cinetin (4 mg/l). Utilizrm-se meio líquido e meio semi-sólido (0,7% de ágr Merck). O ph do meio foi justdo pr 5,8 ± 1 ntes d utoclvgem 121 ± 1 o C por 20 minutos. Foi empregdo o delinemento experimentl inteirmente csulizdo composto de 10 repetições, sendo cd prcel constituíd por 4 tubos e 1 microestc por tubo, o qul foi fechdo com tmp plástic e seus bordos protegidos com vitfilme R. No experimento 2, s microestcs form colocdos em frscos de 250 ml contendo 30 ml de meio de cultur MS, suplementdo com denin (27 mg/l), AIA (5 mg/l), fosfto monobásico de sódio(161,5 mg/l) e Cinetin (4 mg/l), solidificdo com 0,7% de ágr (Merck), vrindo os tipos de tmps entre Metl, Vitfilme e Plástic. O ph do meio foi justdo pr 5,8 ± 1 ntes d utoclvgem 121 ± 1 o C por 20 minutos Aos 30 dis pós repicgem, form vlidos: número de brotos, comprimento de brotos, número de folhs por broto, peso d mtéri fresc e peso d mtéri sec. Foi empregdo o delinemento experimentl inteirmente csulizdo com 5 repetições, sendo cd prcel constituíd por 4 frscos e 2 microestcs por frsco. Os experimentos form instldos em sl de crescimento com tempertur controld de 26 ± 1 o C e fotoperíodo de 16/8 hors (luz/escuro) e 2500 lux de luminosidde fornecid por lâmpds fluorescentes brnc-fri. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultdos com consistênci do meio permitirm concluir que o estdo físico do meio nutritivo não influenciou micropropgção do clone 400 de repolho cultivdo tnto em meio de cultur semi-sólido como em meio de cultur líquido, com utilizção de ponte de ppel de filtro. Já Stewrd (1958), citdo por Murshige (1974), relt que o desenvolvimento in vitro de lgums espécies vegetis, como Dcus crot L., Asprgus officinlis L., como tmbém orquíde, gérber e bromélis, segundo Murshige (1974), são bstnte influencids pels consistênci do meio de cultur. Vermendi e Nvrro (1996) mostrrm que s condições físics do meio teve um influênci importnte n embriogênese

3 832 somátic de plmeir (Phoenix dtylifer L.). O meio líquido foi superior o meio sólido no número de embriões somáticos formdos. Entretnto, utilizção do meio líquido é considerdo economicmente mis viável pr um propgção em mss (Tutorus e Dunstn, 1995). Após 30 dis d repicgem, obteve-se médi de 2,9 brotos por explnte, sendo que o meio semisólido presentou médi de 3,2 brotos, enqunto o meio líquido 2,6 brotos. Os brotos presentrm cor verde-escuro crcterístico do clone, não sendo, portnto, verificdo nenhum specto que pudesse ser relciondo com vitrificção. Lee, Wetzstein e Mutschler (1986) mostrrm que utilizção de meio líquido present condição mis fvorável o surgimento de plnts vitrificds. Não houve diferenç significtiv entre os dois trtmentos qunto o número de folhs produzids. O número de folhs é presumivelmente relciondo à tx potencil de multiplicção, um vez que indic o número de gems lteris (produzids ns xils folires) disponíveis como explntes. Qunto os tipos de tmps empregds, os resultdos mostrrm que s microestcs d fmíli clonl 800, cultivds em frsco de 250 ml fechdos com tmps de metl, vitfilme R e plástico, não presentrm diferençs significtivs no número de brotos e comprimento médio de brotos, produzindo, em médi, 4,7 brotos com 2,6 cm de comprimento, pós 30 dis de cultivo. Esses resultdos são semelhntes os encontrdos por Lentini, Mussell, Mutschler.et l (1988), utilizndo tmps poross no cultivo de Brssic.cmpestris L.. Crvlho, Fvretto e Pinto (1995), estudndo influênci do tipo de tmp no crescimento e desenvolvimento de btt-doce, notrm que houve diferenç no peso d mtéri fresc e sec d plântul. O sistem rdiculr formdo no meio de cultivo líquido foi mis bundnte do que em meio semisólido, concordndo com Grttpgli e Mchdo (1990), os quis reltrm que o sistem rdiculr tende ser mis desenvolvido em meio líquido. Entretnto, esss rízes erm fins e comprids, o contrário ds obtids no cultivo em meio semi-sólido, que erm mis curts, com diâmetro mior. O mior crescimento ds rízes em meio líquido foi em virtude d mior fcilidde de trocs gsoss que ocorrem entre s rízes e o meio de cultur, fvorecids pel utilizção ds pontes de ppel de filtro. Os pesos de mtéri fresc e de mtéri sec de brotos não presentrm diferençs significtivs entre os trtmentos. Esses resultdos form diferentes dqueles encontrdo por Heller et l.(1968) citdo por Clds, Hridsn e Ferreir (1990), o reltrem que tecidos de cenour cultivdos em meio líquido bsorverm miores quntidde de águ do que em meio semisólido. Segundo Clds, Hridsn e Ferreir (1990), o meio semi-sólido tem propriedde de impor restrições à velocidde de difusão de nutrientes em relção o meio líquido, cusndo deficiênci nutricionl ds plnts, principlmente ns espécies mis sensíveis. No entnto, não foi verificdo nenhum sintom de deficiênci nutricionl entre s brotções obtids prtir ds microestcs. Embor não tenh sido verificd, esttisticmente, nenhum diferenç significtiv entre os dois tipos de trtmentos, observou-se que os brotos obtidos no cultivo em meio semi-sólido exibim specto mis lignificdo do que queles produzidos em meio líquido. Bhgylkshni e Singh (1995) trblhndo com bnns, mostrrm que o meio líquido foi melhor pr multiplicção. Eentretnto, o meio com gr presentou mior sobrevivênci d plântul ex-vitro. Foi observdo em repicgens nteriores que, qundo se pertv rosc ds tmps de metl no frsco, impedindo s trocs gsoss com o meio externo, ocorrim superbrotmento e estiolmento dos brotos, em virtude do cúmulo de compostos voláteis, (provvelmente o etileno),no interior dos frscos; entretnto, esss brotções erm frcs e com specto vitrificdo, tornndo-se inviáveis pr multiplicção, pois o umento de compostos voláteis (CO 2 e etileno) no interior dos frscos pode conduzir desordens fisiológics, como redução d respirção, bixs tividdes metbólics, lém de cúmulo de lguns metbólitos, tis como minoácidos e oxoltos.(pierik, (1987). Mrino, Berrdi e Ancherni (1995) tmbém observrm um cúmulo de CO 2 e etileno qundo utilizrm diferentes tmps de plástico e lumínio. N vlição do peso de mteri fresc dos brotos houve diferenç significtiv entre tmps de metl e vitfilme R, sendo que o peso médio de mtéri fresc obtido com o cultivo com tmp de metl foi superior o peso médio obtido com tmp de vitfilme R, conforme pode ser visulizdo n Figur 01. Ess diferenç pode estr relciond o fto de que s tmps de metl impedem pssgem de luz pr o interior do frsco, fzendo com que tod luz sej recebid trvés d prede lterl do frsco, o que diminui quntidde de luz recebid pelo explnte, reduzindo su cpcidde de trnspirção; isso foi observdo pelo excesso de condensção ns predes dos frscos, indicndo que umidde do r no interior do frsco tornou-se mis elevd, diminuindo trnspirção e colborndo pr que os tecidos rmzenssem mior quntidde de águ.

4 833 1,6 1,4 b Peso de mtéri fresc (g) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Metl Plástic Vitfilme Tipos de tmps b FIGURA 1 - Vlores médios de peso de mtéri fresc dos brotos produzidos trvés de segmentos nodis d fmíli clonl 800, em função dos tipos de tmps, o nível de 5% de probbilidde pelo teste de F. Os frscos tmpdos com vitfilme R permitem mior penetrção de luz; com isso, trnspirção é mis elevd, como foi observdo pel usênci de condensção ns predes interns dos frscos; o mbiente interno tornou-se, ssim, mis seco e os brotos não rmzenrm águ nos seus tecidos. Foi observdo, tmbém, redução de té 50% no volume inicil de meio de cultur 30 dis pós instlção do experimento. Esses resultdos diferem dqueles obtidos por Sh, McCown e Peterson (1985), nos quis o uso de vitfilme R pr vedr os frscos de btt (Solnum tuberosum L.) resultou em morte do ápice, diminuição de peso e umento de brotções. N nálise do peso d mtéri sec, não foi verificd nenhum diferenç significtiv entre os trtmentos. N vlição do sistem rdiculr, não houve diferenç significtiv entre os trtmentos qunto o número de rízes; ms o comprimento médio ds rízes produzids no cultivo com tmps de metl e plástic foi superior às rízes produzids com o vitfilme R. O vitfilme R por permitir mior evporção e reduzir o volume inicil do meio de cultur em té 50%, prejudicou o desenvolvimento ds rízes. Esse crescimento pode ter sido fetdo pel mior concentrção de sis devido à evporção de águ do meio de cultur. Por outro ldo, tmp de metl que tem mior resistênci à perd de águ, conservou volume mior de meio, o que permitiu o desenvolvimento norml ds rízes, não cusndo toxidez às rízes pr o seu crescimento (Figur 2). O peso d mtéri fresc ds rízes não presentou diferençs significtivs entre os trtmentos, embor o tmnho ds rízes tenh sido menor qundo cultivds com tmps de vitfilme R. Entretnto, foi observdo que ests rízes tiverm diâmetro mior, cumulndo miores quntiddes de águ nos seus tecidos, compensndo o peso de mtéri fresc qundo comprds s rízes fins e comprids obtids com tmps de metl e plástic. Entre s tmps de metl e plástic, não houve diferenç no peso de mtéri fresc e mtéri sec (Figur 3). Comprndo s tmps de plástico e vitfilme R, o peso de mtéri sec de rízes cultivds com tmps de plástico foi inferior, pois pesr de serem miores em comprimento, els erm muito fins. CONCLUSÕES ) A utilizção de meios de cultur líquido ou semi-sólido não presentou diferençs n multiplicção de repolho in vitro. Entretnto, qulidde dos brotos obtidos em meio semi-sólido gerlmente foi melhor do

5 834 5 Comprimento de riz (cm) b 0 Metl Plástic Vitfilme Tipos de tmps FIGURA 2 - Vlores médios de comprimento de riz produzids trvés de segmentos nodis d fmíli clonl 800, em função dos tipos de tmps, o nível de 5% de probbilidde pelo teste de F. 0,04 Peso de mteri sec (g) 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 b b 0,005 0 Metl Plástic Vitfilme Tipos de tmps FIGURA 3 - Vlores médios de peso de mtéri sec de riz produzid trvés de segmentos nodis d fmíli clonl 800, em função dos tipos de tmps, o nível de 5% de probbilidde pelo teste F.

6 835 que no meio líquido, pois ponte de ppel de filtro utilizd pr sustentr e permitir mior erção d microestc impediu o crescimento de lguns brotos que surgirm sob o ppel de filtro. Dess form, considerse utilizção de meios semi-sólidos mis proprid pr propgção do repolho in vitro. b) N multiplicção do repolho, pode-se utilizr tnto tmps de metl, vitfilme R e plástico, sem fetr qulidde dos brotos produzidos. No entnto, s tmps de metl não deverão ser hermeticmente fechds, sob pen de evitrem s trocs gsoss necessáris o bom desenvolvimento dos explntes. No cso de se utilizr o vitfilme R, dição de um volume mior de meio de cultur por frsco é necessári pr evitr o ressecmento do meio. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BHAGYALAKSHMI,; SINGH, N.S. Role of liquid versus gr-gelled medium in mss propgtion nd ex vitro survivl in bnns. Plnt Cell, Tissue nd Orgn Culture, Dordrecht v.41, n.1, p.71-73, CALDAS, L.S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M.E. Meios Nutritivos. In: TORRES, A.C; CALDAS, L.S.(eds.). Técnics e Aplicções d Cultur de Tecidos de Plnts. Brsíli: ABCTP/EMBRAPA- CNPH, p CARVALHO, R.; FAVARETTO, N.; PINTO, J.E.B.P.. et l Influênci de ftores físicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de btt-doce (Ipome btts (L.) Peir. Ciênci e Prátic, Lvrs v.19, n.2, p , GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropgção. In: TORRES, A.C; CALDAS, L.S. (eds.). Técnics e Aplicções d Cultur de Tecidos de Plnts. Brsíli: ABCTP/EMBRAPA-CNPH, p LEE, N.; WETZSTEIN, H.Y.; SOMMER, H.E. The effect of gr vs. liquid medium on rooting in tissue-cultured Sweetgum. HortScience, Alexndri, v.21, n.2, p , LENTINI, Z.;MUSSELL, H.;MUTSCHLER, M.A.; EARLE, E.D. Ethylene Genertion nd Reversl of Ethylene Effects During Development in vitro of Rpid-cycling Brssic cmpestris L. Plnt Science, Irelnd, v.54, p.75-81, MARINO, G.; BERARDI, G.; ANCHERANI, M. The effect of the type of closure on the gs composition of the hedspce nd the growth of GF 677 pech lmond rootstck cell suspension culture. In Vitro Cellulr Development Biology Plnt, Columbi v.31, n.4, p , MURASHIGE, T. Plnt propgtion through Tissue Cultures. Annul Review Plnt Physiology, Plo Alto, v.25, p , MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rpid growth nd biossy with tobcco tissue cultures. Physiology Plntrum, Copenhgen, v.15, p , PASQUALETTO, P.L.; ZIMMERMAN, R. H.; FORDHAM, I. Gelling gent nd growth regultor effects on shoot vitrifiction of Gl pple in vitro. Journl Americn Society Horticulturl Science, Mount, v.11, p , Nov PIERIK, R.L.M. In vitro culture of higher plnts. Netherlnds: Mtinus Nijhoff Publishing, Closure of test tubes nd flsks p ROMBERGER, J.A.; TABOR, C.A. The Pice bies shoot picl meristem in culture. Americn Journl Botny, Columbus, v.58, p , SHA, L.; McCOWN, B.H.; PETERSON, L.A. Occurrence nd Cuse of Shoot-tip Necrose in Shoot Cultures. Journl Americn Society Horticulturl Science, Mount, v.110, n.5 p , SHINGA, S. Influence of Agr Concentrtion on in vitro Shoot Prolifertion of Mlus spp. Almey nd Pynus communis Seckel. Journl Americn Society Horticulturl Science, Mount, v.107, p , SNIR, I.; EREZ, A. In vitro propgtion of Mlling Merton pple rootstocks. HortScience, Alexndri v.15, p , Aug TAUTORUS, T.E.; DUNSTAN, D.I. Scle-up of embryogenic plnt suspension cultures in bioretors. In: JAIN, M.; GUPTA, P.K. (eds.) Somtic embryogenesis in woody plnts. Dordrecht, Netherlnds: Kluwer Acdemic Publishers, p VERAMENDI, J.; NAVARRO, L. Influence of physicl conditions of nutrient medium nd sucrose on somtic embryogenesis of dte plm. Plnt Cell, Tissue nd Orgn Culture, Dordrecht v.45, n.2, p , My 1996.