DE ALHO (Allium sativum L.)

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1 18 MICROPROPAGAÇÃO LONGO, E A. BULBIFICAÇÃO E. de O. e et l. IN VITRO DE ALHO (Allium stivum L.) IN VITRO MICROPROPAGATION AND BULBING OF GARLIC (ALLIUM SATIVUM L.) ANA ELISA DE OLIVEIRA E LONGO 1, WALTER JOSÉ SIQUEIRA 2, ILENE RIBEIRO DA SILVA PASSOS 3, MARTA DIAS SOARES SCOTT 4, JOAQUIM ADELINO DE AZEVEDO FILHO 5 1 Doutornd do progrm de Pós-grdução em Agricultur Tropicl e Sutropicl do Instituto Agronômico de Cmpins/IAC Av. Brão de Itpur Cix Postl 28 CEP Cmpins, SP nelislongo@gmil.com 2 Pesquisdor do Instituto Agronômico de Cmpins/IAC Av. Theodureto de Almeid Cmrgo nº 1500 Cix Postl 28 CEP Cmpins, SP wlterjs@ic.sp.gov.r 3 Pesquisdor do Instituto Agronômico de Cmpins/IAC Av. Theodureto de Almeid Cmrgo nº 1500 Cix Postl 28 CEP Cmpins, SP irpssos@ic.sp.gov.r 4 Pesquisdor do Instituto Agronômico de Cmpins/IAC Av. Theodureto de Almeid Cmrgo nº 1500 Cix Postl 28 CEP Cmpins, SP scott@ic.sp.gov.r 5 Pesquisdor do Pólo Regionl Leste Pulist/APTA Estrd Municipl Monte Alegre Pinhlzinho Km 03 Cix Postl 01 CEP Monte Alegre do Sul SP joquimdelino@pt.sp.gov.r RESUMO O lho é um espécie de propgção vegettiv, ssim o melhormento genético se sei em métodos que gerem vriilidde genétic, como indução de mutções, vrição somclonl, fusão de protoplstos e trnsformção genétic. Pr que estes métodos possm ser plicdos é necessário o desenvolvimento de protocolos eficientes de regenerção de plnts e ulificção in vitro. Neste trlho, ojetivou-se o estudo de meios de cultur pr o crescimento de ápices culinres com posterior ulificção in vitro d cultivr comercil IAC- Lvíni 1632 (clone 19). Form testds, inicilmente, diferentes concentrções de BAP (0; 5; 10; 20; 40 µm) com posteriores cominções de cinetin (0; 15; 20; 25; 30 µm de BAP x 0; 5; 10; 15; 20 µm de KIN). Pr indução de ulificção in vitro form vlidos meios com diferentes concentrções de scrose (30; 40; 50; 60 e 70 g L -1 ), meio MS (completo e metde d concentrção) e presenç e usênci dos compostos nitrogendos (K ). A nálise esttístic foi sed no delinemento inteirmente csulizdo com testes de médis e regressões polinomiis no SANEST. Os resultdos evidencirm que melhor concentrção de BAP pr crescimento de ápices culinres de lho foi 5 µm, com umento significtivo d mss fresc de ulos. Houve interção significtiv entre os dois reguldores de crescimento (BAP x KIN) pr ltur de plnt. Pr umento de mss de ulo e senescênci de folhs deve-se umentr concentrção de scrose pr 50 g L -1, mnter os compostos do meio MS, ms com usênci de sis nitrogendos. Termos pr indexção: Ápices culinres, reguldores de crescimento, nitrogênio, scrose. ABSTRACT Grlic is vegettively propgted species, so its genetic improvement is sed on methods tht generte genetic vriility, such s muttion, somclonl vrition, protoplst fusion, s well s on genetic engineering. Efficient protocols for the development of plnt regenertion nd susequent in vitro uling re importnt for the employment of some of these methods. The present pper imed to study in vitro culture medi for grlic micropgtion nd uling of IAC-Lvíni 1632 (clone 19) cultivr. Different BAP (0; 5; 10; 20; 40 µm) concentrtions s well s comintions of BAP nd KIN (0; 15; 20; 25; 30 µm BAP x 0; 5; 10; 15; 20 µm KIN) were tested for the development of grlic meristemtic pices. For uling, medi with different concentrtions of sucrose (30; 40; 50; 60 e 70 g.l -1 ), MS medium (full nd hlf concentrtion) nd the presence nd sence of nitrogenous compounds (K nd NH 4 ) were tested. Sttisticl nlysis ws sed on completely rndom design with multiple comprisons nd polynomil regressions of SANEST. The results indicted tht the est concentrtion of BAP for growing meristemtic grlic pices ws 5 M, with significnt increse in fresh mss of uls. Significnt interction ws oserved etween these two growth regultors (BAP x KIN) for plnt height. In order to increse the mss of the ul nd leves senescence the sucrose concentrtion should e incresed to 50 g L -1, keeping the compounds of the MS medium, ut with no nitrogen slts. Index terms: Shoot pices, growth regultors, nitrogen, sucrose. INTRODUÇÃO O Brsil é, tulmente, muito crente em novs cultivres disponíveis os produtores e são poucos os progrms de melhormento pr espécie Allium stivum. O principl ftor é usênci de recominção genétic pelo processo meiótico, em decorrênci de ser o lho, otnicmente, de propgção ssexud (ZEWDIE et l., 2005). (Receido em 13 de ril de 2011 e provdo em 31 de gosto de 2012) Plnt Cell Cult. Micropropg., Lvrs, v.8, n. 1-2, p , 2012

2 Micropropgção e ulicção in vitro Pr otenção de novs cultivres, o melhormento genético sei-se n seleção de plnts mutntes nturis ou induzidos, explorção d vrição somclonl (KAEPPLER et l., 2000), fusão de protoplstos e,tulmente, por meio de trnsformção genétic (MARTÍN-URDÍROZ et l., 2004). A trnsformção genétic mostr-se promissor no desenvolvimento de novs cultivres de lho. Entretnto, é necessário desenvolver protocolos regenertivos de plnts, prtir de diferentes tipos de explntes (ROBLEDO- PAS et l., 2000). Nesse sentido, ápices culinres ou meristemáticos de lho, exemplo de emriões ns outrs espécies de propgção sexul, podem ser utilizdos pr trnsformção genétic como fonte primári pr iolístic ou co- cultivo com Agrocterium tumefsciens (KENEL et l., 2010). Pr que isso sej estelecido como rotin no lortório é preciso desenvolver protocolos pr o crescimento de ápices culinres que, pós o processo de trnsformção, se desenvolvm em plnts complets té ulificção in vitro, evitndo perds durnte climtção ds plnts (KIM et l., 2003). O único trlho que oteve sucesso n tenttiv de induzir ulificção in vitro, utilizndo estresse hídrico pr umentr o potencil osmótico do meio de cultur dicionou lts concentrções de scrose ( g L -1 ) (KIM et l., 2003). N cultur de ápices culinres in vitro, é frequente o umento do número de ulos chochos por influênci do fornecimento constnte do nitrogênio do meio MS (COSTA et l., 1993). So condições de cultivo cmpo, o distúrio genético/fisiológico do lho conhecido como pseudoperfilhmento ou superrotmento (MELO; OLIVEIRA, 1999), é muito comum nos lhos nores e nos precoces e pode ser influencido por lts concentrções de N e por lt umidde n fse de desenvolvimento dos ulos (RESENDE; SOUZA, 2000). Há correlção d frequênci de ulos chochos com concentrções crescentes de N (MAROUELLI et l., 2002). Ojetivou-se, neste trlho, relizr experimentções com cultivr de lho comercil IAC Lvíni 1632 (clone 19), testndo-se diferentes concentrções de 6-enzilminopurin (BAP) e em cominções com cinetin (KIN), seguid de ulificção em diferentes concentrções de scrose. Oservou-se, tmém, o efeito d presenç e usênci de compostos nitrogendos presentes no meio ásico MS. no desenvolvimento dos ulos e n senescênci de folhs. MATERIAL E MÉTODOS O mteril vegetl utilizdo foi o clone 19 d cultivr IAC Lvíni 1632, otido por cultur de tecidos in vitro (SIQUEIRA et l., 1996). Os explntes utilizdos consistirm de ápices culinres retirdos de ulilhos d cultivr de 0,3 0,5 mm, conforme descrito por Longo (2009). Os ápices e plnts form inoculdos em frscos com 40 ml de meio de cultur. Pr todos os trtmentos, dotou-se o meio de cultur MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) como ásico com 30 g L -1 de scrose, solidificdo com 6 g L -1 de ágr. O ph do meio de cultur foi justdo pr 5,8 ntes d utoclvgem. O meio MS foi suplementdo com diferentes concentrções de BAP, cinetin e scrose, conforme descrito pr cd trtmento seguir. Todos os ápices excisdos pr uso nos experimentos permnecerm inicilmente no escuro, por um semn 25 ± 1 C. Em seguid, form trnsferidos pr sl de crescimento em iluminção rtificil e fotoperíodo de 16 hors de luz e 8 hors de escuro 27/24 C (di/noite) num intensidde de 30 µmol. m -2.s -1. Ests form s condições de cultivo pr todos os trtmentos descritos seguir. Testrm-se diferentes concentrções de BAP (0; 5; 10; 20 e 40 µm). O delinemento experimentl foi inteirmente csulizdo, com cinco trtmentos e 10 repetições, sendo um ápice por frsco, um repetição, totlizndo 50 ápices. Após 30 dis, s plnts form vlids qunto à ltur (cm) e iomss fresc (g). Em seguid, form trnsferids pr meio MS, contendo 60 g L -1 de scrose, visndo à indução de ulificção in vitro e form mntids por mis 30 dis. Após sete dis de cur Plnt Cell Cult. Micropropg., Lvrs, v.8, n. 1-2, p , 2012

3 20 LONGO, A. E. de O. e et l. (secgem à tempertur miente), iomss sec dos ulos otidos foi medid (g). Em outro experimento foi vlid interção entre dois reguldores de crescimento em um cominção ftoril de BAP (0; 15; 20; 25; 30 µm) x KIN (0; 5; 10; 15; 20 µm). O experimento foi conduzido no delinemento esttístico inteirmente csulizdo, em rrnjo ftoril (5x5) com 12 repetições por trtmento, onde cd frsco continh um ápice como repetição, totlizndo 300 ápices. Após 30 dis, s plnts form vlids qunto à ltur (cm). As plnts otids no experimento nterior (BAP x KIN) form trnsferids pr novos meios MS, contendo diferentes concentrções de scrose (30; 40; 50; 60 e 70 g L -1 ), visndo à indução de ulificção in vitro. Após 90 dis, form vlids rzão ulr, ou sej, relção: diâmetro do pseudocule n ltur do colo/diâmetro d prte medin do ulo, propost por Mnn (1952); iomss sec e fresc (g) do ulo e porcentgem de plnts que formrm ulos. Visndo vlir tx de ulificção in vitro, form feits modificções de concentrção do meio MS (completo e ½ d concentrção), presenç e usênci dos compostos nitrogendos (K ) e scrose no controle do chochmento (perd de águ) dos ulos, em rzão d emissão de rotos e não dormênci pós ulificção in vitro. Pr este experimento, form inoculdos 200 ápices culinres pr crescimento em MS com 5 µm de BAP. As plnts otids form distriuíds em 10 trtmentos: ) MS + 60 g L -1 de scrose; ) ½ MS + 60 g L -1 de scrose; c) MS (sem K ) + 60 g L -1 de scrose; d) ½ MS (sem K ) + 60 g L -1 de scrose; e) MS + 30 g L -1 de scrose; f) ½ MS + 30 g L -1 de scrose; g) MS (sem K ) + 30 g L -1 de scrose; h) ½ MS (sem K ) + 30 g L -1 de scrose; i) ágr-águ + 60 g L -1 de scrose; j) ágr-águ + 30 g L -1 de scrose. Cd trtmento foi constituído de 18 repetições, no delinemento inteirmente csulizdo. Após 60 dis no meio de ulificção, vlirm-se crcterístics em escl de nots de 1 4 pr necrose ou senescênci de folhs: not 1- folhs completmente secs; not 2- somente se d plnt ind verde; not 3- plnt com folhs verdes e somente com pont sec e not 4- completmente verdes, lém d iomss sec (g) d prte ére. Após 35 dis de cur (secgem à tempertur miente), iomss (g) de ulos secos foi medid. As nálises de vriânci dos experimentos, os contrstes de médis e regressões polinomiis form feitos no Progrm SANEST (MACHADO; ZONTA, 1991). Utilizou-se o teste de Tukey 5% de proilidde pr comprções entre s médis. RESULTADOS E DISCUSSÃO N Figur 1, encontrm-se os resultdos otidos de ápices culinres do lho comercil IAC Lvíni 1632 (clone 19), em concentrções crescentes de BAP e que, pós 30 dis, form trnsferids pr meio MS com 60 g L -1 de scrose pr ulificção. Emor não diferindo entre si, tods s concentrções de BAP promoverm mior ltur d plnt (Figur 1), diferindo significtivmente do meio de cultur com usênci de BAP (controle). A mesm tendênci foi oservd pr mss fresc de plnt (Figur 1). Verificouse ind, que qunto à mss sec de ulo (Figur 1) menor concentrção de BAP (5 µm) foi únic que diferiu esttisticmente d usênci desse reguldor de crescimento. A melhor concentrção indicd pr desenvolvimento de ápice culinr ns condições do presente experimento deve ser menor (5 µm) por questões relcionds o lto custo dos reguldores de crescimento e tmém pr evitr riscos de hiperhidricidde dos explntes, muito comum com o uso de lts concentrções de BAP (IVANOVA et l., 2006). Em trlhos semelhntes, com ápice culinr d cultivr seminore Amrnte, pesr do explnte estr determindo e competente pr desenvolvimento (KERBAUY, 1999), tmém houve necessidde d dição de reguldores de crescimento como 2-Ip, AIB ou ANA (ILLG; SIQUEIRA, 1986; MORICONI et l., 1990; TORRES et l., 2000). Plnt Cell Cult. Micropropg., Lvrs, v.8, n. 1-2, p , 2012

4 Micropropgção e ulicção in vitro No experimento envolvendo KIN em cominção com BAP, estão presentdos ns Figurs 2 e 3 os vlores mis expressivos de R 2 encontrdos neste trlho (> 8%). N Figur 2, oserv-se que não houve diferençs de crescimento ns doses de BAP com 20 µm de KIN. Altur de plnt (cm) 2 18,0 16,0 14,0 12,0 1 8,0 6,0 4,0 2,0 * y1= -152x 2 + 0,7562x + 8,2005 R 2 = 55,41 y2= -014x x + 0,4348 R 2 = 42,45 y3= -0158x x + 0,4314 R 2 = 31,68 1, Concentrção de BAP (µm) 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Mss fresc de plnt (g) Mss sec de ulo (g) Altur de plnt Mss fresc de plnt Mss sec de ulo Altur de plnt pel regressão 1 Mss fresc de plnt pel regressão 2 Mss sec de ulo pel regressão 3 FIGURA 1 Médis ds crcterístics: ltur de plnt (cm) mss fresc de plnt (g) mss sec de ulos (g); em meios contendo BAP (0; 5; 10; 20; 40 µm), d cultivr comercil de lho IAC-Lvíni 1632 (clone 19), com posterior trnsferênci pr scrose (60 g L -1 ).*Médis seguids por letrs distints diferem entre si o nível de 5% de significânci pelo teste de Tukey. Altur de plnt (cm) 4,1 4,0 3,9 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,1 * y= x x + 4,00149 R 2 86, Concentrção de BAP (µm) Comindo com 20 µm de KIN Comindo com 20 µm de KIN pel regressão FIGURA 2 Concentrções de BAP (0; 15; 20; 25; 30 µm) pr crcterístic ltur de plnt in vitro prtir de ápices culinres d cultivr comercil de lho IAC-Lvíni 1632 (clone 19). *Médis seguids por letrs distints diferem entre si o nível de 5% de significânci pelo teste de Tukey. Plnt Cell Cult. Micropropg., Lvrs, v.8, n. 1-2, p , 2012

5 22 LONGO, A. E. de O. e et l. Ápices culinres possuem competênci e determinção pr crescimento, desde que sejm fornecids s condições necessáris de nutrição e luminosidde. Auxins e citocinins endógens são sintetizds pelos primórdios folires dos ápices culinres e rdícul, respectivmente, e podem suprir em prte demnd pr crescimento e enrizmento. A retomd do crescimento no sistem in vitro se dá por influênci d presenç de reguldores de crescimento e demis constituintes do meio de cultur (KERBAUY, 1999). Conforme oservdo ns Figurs 2 e 3, conclui-se que podem ser utilizds cominções ds dus citocinins (KIN x BAP) e tmém o BAP isoldo nos meios de cultur pr crescimento de ápice culinr do clone 19. O meio de cultur que proporcionou menor vlor de ltur de plnt (3,31 cm) foi o trtmento 10 µm de KIN x 20 µm de BAP, diferindo, esttisticmente, pens do trtmento 25 µm de BAP x 0 µm de KIN com mior vlor (5,39 cm) de ltur de plnt (Figur 3). Após vlição d ltur ds plnts otids no experimento ftoril, ests form trnsferids pr cinco trtmentos de meios de cultur com diferentes concentrções de scrose pr ulificção in vitro. O gráfico ds crcterístics rzão ulr (diâmetro do pseudocule pelo diâmetro mior do ulo); iomss sec e fresc (g) do ulo e porcentgem de plnts que formrm ulos visndo à ulificção in vitro, encontrse n Figur 4. P r rz ão ulr, o men or vlor i ndi c conformção dequd de ulo, onde região d inserção do pseudocule é reduzid, fvorecendo cur com menores perds de águ. Qundo rzão ulr reduz-se níveis inferiores 0,5,o ulo encontr-se completmente formdo (MANN, 1952). N Figur 4, oserv-se que rzão ulr próxim idel ( 0,5) é Altur de plnt (cm) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 * y1= x x + 4,8068 R 2 = 80,9 y2= 07532x 2-0,20992x + 4,9166 R 2 = 91,6 y3= x 2-0,222701x + 5,09403 R 2 = 91,6 1, Concentrção de KIN (µm) Comindo com 15 µm de BAP Comindo com 20 µm de BAP Comindo com 25 µm de BAP Comindo com 15 µm de BAP pel regressão 1 Comindo com 20 µm de BAP pel regressão 2 Comindo com 25 µm de BAP pel regressão 3 FIGURA 3 Concentrções (15; 20; 25 µm) de BAP e (0; 5; 10; 15; 20 µm) de KIN no experimento ftoril pr crcterístic ltur d plnt in vitro prtir de ápices culinres d cultivr comercil de lho IAC-Lvíni 1632 (clone 19). *Médis seguids por letrs distints diferem entre si o nível de 5% de significânci pelo teste de Tukey. Plnt Cell Cult. Micropropg., Lvrs, v.8, n. 1-2, p , 2012

6 Micropropgção e ulicção in vitro de 50 g L -1 de scrose, diferindo esttisticmente ds demis concentrções. N medid em que houve umento d concentrção de scrose, houve respost crescente pr rzão ulr (Figur 4). D mesm form, mss fresc de ulo n concentrção de scrose 50 g L -1 foi stisftóri (1,58 g), pesr de não mostrr diferenç entre s demis concentrções de scrose testds (Figur 4). Meios de cultur que induzm mior mss fresc ou sec devem ser os seleciondos, pois fcilitrão propgção posterior em sustrto não estéril (RESENDE, 1993). N Figur 4, oserv-se decréscimo n crcterístic de mss fresc (g) com redução d concentrção de scrose no meio de cultur, o que tmém foi oservdo n crcterístic d rzão ulr. Não houve diferençs pr mss sec de ulo (Figur 4), ms por outro ldo, houve contrstes significtivos de mss fresc, indicndo que perd de águ ou o cúmulo de águ nos tecidos dos ulos seguem pdrões distintos de cordo com concentrção de scrose. Pode-se concluir que melhor concentrção de scrose no meio de cultur, pós o crescimento do ápice culinr pr ulificção de lho foi 50 g L -1 por reunir os vlores de máxim mss sec de ulo e rzão ulr dequd ( 0,5). Resslte-se que, pesr de ser otid menor rzão ulr n concentrção de 30 g L -1 (0,36), os vlores de mss fresc e ulificção form inferiores outros trtmentos. Nos experimentos discutidos nteriormente, oservou-se que ulificção ocorre in vitro, sem interrupção do desenvolvimento vegettivo ds plnts, como em condições nturis onde plnt entr em senescênci com sec contínu ds folhs té mturção e dormênci dos ulos por ocsião d colheit. Ns condições in vitro, folhs novs continum sendo emitids e, por ess rzão, os ulos não entrm em dormênci, ocorrendo mior tx de chochmento (perd de águ do ulo). y1= 0,1036x R 2 = 92 y2= x x - 0,2978 R 2 = 85,5 y3= x x + 0,5310 R 2 = 27,07 0,9 1,8 Rzão Bulr 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 * c c 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 Mss sec e fresc de ulo (g) 0,1 0, Concentrção de scrose (g.l -1 ) Mss Fresc de Bulo Mss Sec de Bulo Rzão Bulr Mss Fresc de Bulo pel regressão 2 Rzão Bulr pel regressão 1 Mss Sec de Bulo pel regressão 3 FIGURA 4 Concentrções de scrose (30; 40; 50; 60; 70 g L -1 ), visndo ulificção in vitro, d cultivr comercil de lho IAC-Lvíni 1632 (clone 19), pós cultur ds plnts no experimento de BAP x KIN, pr s vriáveis: rzão ulr, mss fresc e sec de ulos (g). *Médis seguids por letrs distints diferem entre si o nível de 5% de significânci pelo teste de Tukey. Plnt Cell Cult. Micropropg., Lvrs, v.8, n. 1-2, p , 2012

7 24 LONGO, A. E. de O. e et l. No sistem in vitro são fornecidos continumente sis mineris (inclusive nitrogênio) lém d elevd umidde reltiv presentes nos frscos de cultur (MAGALHÃES, 1986). Avliou-se emissão de novs folhs (rotções),durnte fse de trnsferênci pr meio de cultur de ulificção, modificndo-se s concentrções do meio MS e s quntiddes de sis nitrogendos, lém de testr dus concentrções de scrose. As médis ds crcterístics vlids de mss de ulo (g), escl de nots (1 4) pr specto d prte ére, mss sec (g) de folh e de ulo estão n Tel 1. A mss sec de folh foi de ix discriminção pr escolh de meios de cultur. Por outro ldo, s vriáveis de mior mplitude de vrição form escl de nots ds folhs e iomss sec de ulo durnte fse finl de ulificção. Oservou-se (Tel1) que os meios de cultur com rzão ulr mis próxim do idel ( 5,0) form queles que continhm ½ MS + 60 g L -1 de scrose e MS completo com 60 g L -1 de scrose, porém mos sem K. É sido que, reduzindo-se disponiilidde do nitrogênio n fse de indução e crescimento do ulo, pode-se reduzir produção de novs folhs, melhorndo posteriormente su conservção durnte o processo de cur (BARKER; MILLS, 1980). As cominções de MS e nitrogênio n concentrção de 30 g L -1 de scrose não mostrrm efeito significtivo no umento d mss sec de ulo e mior senescênci de folhs. Pr umento de mss de ulo, simultnemente, com senescênci de folhs, durnte o processo de ulificção in vitro, deve-se umentr concentrção de scrose, fornecer nutrientes pelo MS, ms retirr os compostos nitrogendos. Resslte-se que fse de crescimento de ápice é nterior esse processo de ulificção e necessit de condições fvoráveis de nutrição. Yuri et l (2004), com cultivr nore Cçdor induzirm,primeiro, o superrotmento in vitro com vernlizção prévi dos ulos (dodores de ápices) e depois trnsferiu pr meio de crescimento dos mesmos. Com isso, oteve um tx de multiplicção inferior o otido por Moriconi et l. (1990) e por Illg (1995). Sugerese, prtir do presente trlho, indução de superrotmento de plnts in vitro, umentndo-se os TABELA 1 Médis ds crcterístics vlids: mss de ulo (g), escl de nots (1 4) pr necrose e colorção d prte ére (folhs) e mss sec de folh de ulo (g) em meios de cultur (1 10) com vrição d concentrção do meio MS, de scrose e de nitrogênio pr cultivr comercil de lho IAC-Lvíni 1632 (clone 19). Meios Mss Sec de Folh (g) (1) Escl de Nots ds Folhs (2,5) Mss Sec Bulo (g) (3) MS + 60 Sc. 0,17c 2,20cd 0,73 (4) ½ MS + 60 Sc. 0,21c 2,07cd 0,57 MS + 60 Sc. s/n 0,11c 1,43d 0,40c ½ MS + 60 Sc. s/n 9c 1,53cd 0,48c MS + 30 Sc. 0,40 3,63 0,24cd ½ MS + 30 Sc. 0,26 2,34cd 0,30cd MS + 30 Sc. s/n 0,11c 2,54 0,23cd ½ MS + 30 sc. s/n 0,12c 2,14cd 0,27cd ágr-águ + 60 sc. 0,11c 1,32d 0,19cd ágr-águ + 30 sc. 0,20c 2,48c 8d Sc. = scrose; s/n = sem K ; Nº = número; MS = MURASHIGE & SKOOG (1962). (1) CV(%) = 6,6; (2) CV(%) = 22.2; (3) CV(%) = 11,3. (4) Médis seguids por letrs distints diferem entre si o nível de 5% de significânci pelo teste de Tukey. (5) Nots de folhs: folhs completmente secs (not 1), somente se d plnt ind verde (not 2), plnt somente com pont ds folhs secs (not 3) e completmente verdes (not 4). Plnt Cell Cult. Micropropg., Lvrs, v.8, n. 1-2, p , 2012

8 Micropropgção e ulicção in vitro compostos nitrogendos do meio MS e depois trnsferênci ds plnts pr meio com lt concentrção de scrose pr ulificção. CONCLUSÕES Pr crescimento inicil de ápice culinr e posterior formção de ulo in vitro, o meio mis dequdo é MS crescido de 5 µm de BAP. Pr umento d iomss de ulo com senescênci de folhs, durnte o processo de ulificção in vitro, deve-se umentr concentrção de scrose pr 50 g L -1, e retirr os compostos nitrogendos. AGRADECIMENTOS À Técnic de lortório Ruly Máximo Rello Moretti, pel colorção no desenvolvimento dos experimentos no Lortório de Cultur de Tecidos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARKER, A. V.; MILLS, H. A. Ammonium nd nitrte nutrition of horticulturl crops. In: JOHN WILEY; SONS, INC., HOBOKEN. Horticulturl Reviews, Volume 2, New Jersey, USA: J. Jnick, 1980, p COSTA, T. M. P.; SOUZA, R.J.; SILVA, A.M. Efeitos de diferentes lâmins de águ e doses de nitrogênio sore cultur do lho (Allium stivum L. cv. Juréi). Ciênci e Prtic, v.17, n.3, p , ILLG, R. D.; SIQUEIRA, W. J. Vrição somclonl em lho. Informe Agropecuário, v.12, n.142, p ILLG, R. D. Alho (Allium stivum L.). Produção de Microulilhos de lt qulidde. In: Lee Sheng Gerld. Biofárics: Produção industril de plnts in vitro. Arrs: Universidde Federl de São Crlos (UFSCr), p IVANOVA, M.et l. Endogenous cytokinins in shoots of Aloe polyphyll cultured in vitro in reltion to hyperhydricity, exogenous cytokinins nd gelling gents. Plnt Growth Regultion, v.50, p , KAEPPLER, S. M.; KAEPPLER, H.F.; RHEE,Y. Epigenetic spects of somclonl vrition in plnts. Plnt Moleculr Biology, Netherlnds, v.43, p , KENEL, F.; EADY, C.; BRINCH, S. Efficient Agrocterium tumefciens - medited trnsformtion nd regenertion of grlic (Allium stivum) immture lef tissue. Plnt Cell Reports, v.29, p , KERBAUY, G.B. Competênci e determinção celulr em cultur de céluls e tecidos de plnts. In: TORRES, A.C., CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultur de tecidos e trnsformção genétic de plnts. Brsíli: Emrp-SPI, v.2, p KIM, E. K.et l. High frequency of shoot multipliction nd ullet formtion of grlic in liquid cultures. Plnt Cell, Tissue Orgn Culture, v.73, p , LONGO, A. E. O. Micropropgção de lho e ginogênese in vitro de ceol p. Dissertção (Mestrdo em Genétic, Melhormento Vegetl e Biotecnologi) - Instituto Agronômico de Cmpins (IAC), Cmpins, MANN, L.K. Antomy og the grlic ul nd fctors ffecting ul development. Hilgrdi, v.21, n.8, p , MACHADO, A. A.; ZONTA, E. P. Mnul do SANEST: Sistem pr nlise esttístic pr microcomputdores. Pelots, UFPel, p.102, MAGALHÃES, J. R. Nutrição minerl de lho. Informe Agropecuário, v.12, n.148, p.20-30, MAROUELLI, W. A. et l. Produção e qulidde de lho so regimes de águ no solo e doses de nitrogênio. Horticultur Brsileir, v.20, n.2, p , MARTÍN-URDÍROZ, N.et l. Effect of light on the orgnogenic illity of grlic roots using one-step in vitro system. Plnt Cell Reports, v.22, p , MELO, J. P. L.; OLIVEIRA, A. P. Produção de lho em função de diferentes níveis de águ e esterco ovino no solo. Horticultur Brsileir, v.17, n.1, p.11-15, MORICONI, D. N.; CONCI, V. C.; NOME, S. F. Rpid multipliction of grlic (Allium stivum L.) in vitro. Phyton, v.51, n.2, p , MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A. Revised medium for rpid growth nd iossys with tocco tissue cultures. Physiologi Plntrum, v.15, p , Plnt Cell Cult. Micropropg., Lvrs, v.8, n. 1-2, p , 2012

9 26 LONGO, A. E. de O. e et l. RESENDE, F.V. Comportmento em condições de cmpo, de plnts de lho (Allium stivum L.) otids por cultur de meristems. 63 p. Dissertção (Mestrdo) - Universidde Federl de Lvrs, Lvrs, RESENDE, G. M.; SOUZA, R. J. Concentrções e épocs de plicção de nitrogênio sore produtividde e crcterístics comerciis do lho. Horticultur Brsileir, v.18, p , Suplemento. ROBLEDO-PAS, A.; VILLALOBOS-ARÁMBULA, V. M.; JOFRE-GARFIAS, A. E. An efficient plnt regenertion of grlic (Allium stivum L.) y root-tip culture. In Vitro Cellulr & Development Biology - Plnt, v.36, n.5, p , SIQUEIRA, W. J.; TAVARES, M.; TRANI, P. E. Vrieddes de lho pr o Estdo de São Pulo. Boletim Técnico Instituto Agronômico, Cmpins, p.165, TORRES, A. C.et l. Shoot tip culture nd thermotherpy in recovering virus free plnts of grlic. Horticultur Brsileir, v.18, n.3, p , YURI, J. E.et l. Vernlizção do lho pr cultivo in vitro. Horticultur Brsileir, v.22, n.3, p , ZEWDIE, Y.et l. The first genetic linkges mong expressed regions of the grlic genome. Journl of the Americn Society for Horticulturl Science, v.130, n. 4, p , Plnt Cell Cult. Micropropg., Lvrs, v.8, n. 1-2, p , 2012