Desinfestação de Explantes de Videira cv. Niagara Rosada Visando Estabelecimento In Vitro

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1 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 Desinfestação de Explantes de Videira cv. Niagara Rosada Visando Estabelecimento In Vitro Carolina Wisintainer 1 ; Sarah Cristine Martins Neri 2 ; Lindomar Manoel Rezende 3 ; Sebastião Pedro da Silva Neto 4 1 Graduada em Agronomia, UEG - UnU Ipameri, CEP: carolinawisintainer@hotmail.com 2 Graduanda do Curso de Engenharia Florestal da UEG - UnU Ipameri 3 Graduando do Curso de Agronomia da UEG - UnU Ipameri 4 Orientador, docente do Curso de Agronomia da UEG - UnU Ipameri, sebastiao@campo.com.br PALAVRAS-CHAVES: Vitis Labrusca L., micropropagação, assepsia. 1 INTRODUÇÃO A viticultura brasileira ocupa uma área superior a hectares. Desse total, ha estão no Estado de Santa Catarina, onde a viticultura caracteriza-se por ser uma atividade típica da agricultura familiar e, conseqüentemente, contribui para a fixação do homem no meio rural (Rosier e Losso, 1997) O cultivo de videiras demonstra, potencialmente, ser alternativa para o desenvolvimento econômico e social de pequena propriedades e da agricultura familiar. Porém, tal potencialidade não vêm sendo explorada pelos produtores. A principal dificuldade encontrada pelo setor é a obtenção de mudas de videiras isentas de pragas e doenças. Uma das alternativas para isso seria a importação de mudas de outros países, como a França, o que torna o processo dispendioso, o que acaba frustrando muita das iniciativas. Tradicionalmente, a propagação vegetativa da videira realiza-se através de estacas caulinares, com duas a três gemas, as quais são enraizadas em substratos específicos (Schuck et al., 1993). Na década de 90, observou-se uma queda considerável na produtividade dos vinhedos e uma forte redução da área plantada, decorrentes de viroses e morte de plantas, causadas pela fusariose (Fusarium oxysporum Sch. f.sp. herbemontis) e

2 margarodes (Eurhizococcus brasiliensis) (Schuck et al., 1993; Rosier e Losso, 1997). Em virtude da ocorrência de tais viroses, foram realizados trabalhos de seleção, propagação in vitro, produção e certificação de plantas matrizes e mudas (Silva et al., 1997). As viroses afetam severamente a produção, a qualidade da uva e podem causar tanto a morte de plantas jovens quanto de adultas, além de diminuírem sensivelmente a vida útil dos vinhedos. Estes prejuízos têm sido verificados em diversos países vitícolas, constando da literatura mundial o registro de perdas que podem chegar a 70% na produção e até 4ºBrix no teor de açúcar da uva (Kuhn e Martins, 2009). Com o desenvolvimento de uma viticultura tecnificada e industrial, impulsionada pela forte demanda de matéria-prima (uva para vinhos e sucos) e pelo aumento no consumo de vinhos tintos de melhor qualidade, tem tornado o mercado atrativo e gerado grande procura de plantas matrizes e mudas certificadas para uso em novos plantios (Silva, 2002). A micropropagação pode ser uma alternativa viável para a multiplicação em larga escala de plantas para porta-enxertos ou matrizes. A micropropagação de videiras consiste basicamente no processo de enraizamento de brotações axilares ou adventícias multiplicadas in vitro, para a regeneração de plantas inteiras. Esse processo possibilita a rápida multiplicação de plantas, a obtenção de plantasmatrizes livres de vírus, a propagação de híbridos e a preservação de germoplasmas de interesse (Rosier e Losso, 1997). Os explantes normalmente utilizados são segmentos nodais, ápices meristemáticos e meristemas (Passos et al., 1985). A primeira etapa da micropropagação é o estabelecimento in vitro do material a ser multiplicado e, para tanto, deve-se determinar a melhor metodologia para desinfestação dos explantes a serem inoculados. Após a escolha do tecido que será empregado como explante, procede-se o tratamento de desinfestação do mesmo, a fim de eliminar microorganismos exógenos, para a obtenção de um bom resultado no final do processo de estabelecimento in vitro (Rocha, 1999; Souza et al., 2003). Em espécies lenhosas, a contaminação dos explantes é um dos principais problemas do cultivo in vitro e depende também da procedência do material vegetal utilizado, que pode ser de casa de vegetação ou do campo (Pereira et al., 2003).

3 Na maioria dos casos, a presença de fungos e bactérias ocorre poucos dias após a inoculação. Em alguns casos, a presença de bactérias e fungos nas plantas é detectada após algum tempo de cultivo, geralmente quando um grande número de plantas já está em produção. Além disso, por serem de difícil visualização, são facilmente transmitidas de um material para outro durante a manipulação dos explantes para a inoculação in vitro. Quando as condições do meio de cultura (nutrição, ph) tornam-se favoráveis ao seu desenvolvimento, os fitopatógenos passam a competir por nutrientes minerais e carboidratos do meio de cultura, comprometendo a multiplicação e o desenvolvimento dos explantes (Montarroyos, 2000), podendo levá-los rapidamente à morte. Esta deterioração dos explantes está relacionada com a produção de metabólitos fitotóxicos pelos fitopatógenos, tais como os ácidos láctico e acético e cianeto (Pereira et al., 2003). Um problema freqüente durante o isolamento de explantes é a oxidação de compostos fenólicos, que são liberados pelas células, relatam Grattapaglia e Machado (1998). Segundo Teixeira et al. (2001), a oxidação dos polifenóis leva à produção de substâncias amareladas de composição complexa, do tipo quinonas, que se pode ligar a proteínas das membranas ou enzimas, acarretando toxidez e morte da célula. Para minimizar a contaminação microbiana, inúmeros protocolos de esterilização são apresentados por diversos autores. Estes relatam o uso de substâncias como hipoclorito de sódio e etanol 70% e, em alguns casos, a adição de antibióticos ao meio de cultura. A utilização de antibióticos para o controle e erradicação de microrganismos contaminantes é frequente, podendo os mesmos serem adicionados ao meio de cultura ou imersão dos em banhos sob agitação, durante alguns dias (Grattapaglia e Machado, 1998). A concentração da solução desinfestante e o tempo de exposição podem variar muito os índices de descontaminação, no que se faz necessário à adequação do protocolo de desinfestação. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo para a desinfestação de explantes de videira cv. Niagara Rosada (Vitis Labrusca L.), visando ao seu estabelecimento in vitro. 2 MATERIAL E MÉTODOS O Experimento foi realizado na Universidade Estadual de Goiás, Unidade Universitária de Ipameri. A partir das plantas matrizes de uva cv. Niagara Rosada

4 (Vitis Labrusca L.) mantidas em campo, foram retirados os explantes, e só então aplicados os processos de assepsia. Os materiais foram conduzidos ao laboratório onde passaram por uma pré-limpeza, empregando-se com água destilada e algumas gotas de detergente comercial. Após esse procedimento, os explantes foram colocados em álcool 70% (v/v) por três minutos. Em câmara de fluxo laminar, os explantes foram retirados do álcool e esterilizados com hipoclorito de sódio (NaClO) a 1%. Em seguida, os explantes foram inoculados em meio MS (Murashige & Skoog, 1962), sem reguladores de crescimento, acrescido de 3,0% de sacarose. O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 1, combinando quatro tempos de contato em hipoclorito de sódio (15, 20, 25 e 30) consistindo de quatro tratamentos com cinco repetições contendo três explantes em cada repetição. As avaliações foram realizadas de sete em sete dias, consistindo da avaliação das contaminações fúngicas e bacterianas, oxidação e desenvolvimento do explante determinadas por avaliação visual. Os dados foram analisados pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Para melhor visualização dos resultados, os dados originais foram transformados em porcentagens. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO O processo de desinfestação de segmentos nodais de uva foi fundamental para evitar e/ou reduzir as contaminações provocadas por fungos e bactérias. Segundo Grattapaglia e Machado (1998), o processo de desinfestação dos explantes é fator fundamental para as demais etapas do estabelecimento in vitro. No presente trabalho pode-se verificar que nenhum dos tratamentos tiveram contaminação com bactérias ou fungos (Tabela 1), esses resultados mostram que a maior parte das infestações pode ocorrer pela falta de cuidados com a contaminação do material durante o processo de estabelecimento do cultivo in vitro ou por falta de uma correta desinfestação dos materiais.

5 Tabela 1. Porcentagem de desenvolvimento, oxidação, fungo e bactéria de explantes de videira cv. Niagara Rosada em diferentes tempos de contato com hipoclorito de sódio (NaClO). Ipameri-GO, Tempo Desenvolvimento Oxidação Fungo Bactéria 15 min 52,0 a 40,0 a 12,0 a 0,0 a 20 min 52,8 a 44,0 a 0,0 a 0,0 a 25 min 50,0 a 40,0 a 0,0 a 0,0 a 30 min 42,0 a 40,0 a 0,0 a 0,0 a CV (%) 33,54 10,91 44,21 0,00 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey, p 0,05, para cada tempo de contato do explante no hipoclorito de sódio (NaClO). Em relação à oxidação (Figura 1), não foi observada uma variação estatística significativa entre os tratamentos. O nível de oxidação observado nos explantes não foi suficiente para atrapalhar o estabelecimento do cultivo in vitro. De acordo com Erig e Schuch (2005) a concentração e o tempo de exposição aos desinfetantes dependem do material vegetal e diferentes partes da planta apresentam respostas variadas quanto à sensibilidade dos tecidos. Uma desinfestação eficiente elimina os microorganismos e não causa danos ou morte aos tecidos. Oxidação min 20 min 25 min 30 min Figura 1. Porcentagem de oxidação dos explantes de videira cv. Niagara Rosada em diferentes períodos de contato em hipoclorito de sódio (NaClO). Ipameri-GO, 2010.

6 No desenvolvimento dos explantes também não houve diferenças significativas entre os tratamentos (Figura 2). Pode-se observar que em todos os tratamentos verificou-se efeito quadrático do desenvolvimento dos explantes, todos os período de contato proporcionou o aumento do desenvolvimento (Figura 3). Desenvolvimento min 20 min 25 min 30 min Figura 2. Porcentagem de desenvolvimento dos explantes videira cv. Niagara Rosada nos diferentes períodos de contato em hipoclorito de sódio (NaClO). Ipameri-GO, Segundo Erig e Schuch (2005), a sobrevivência dos segmentos nodais é indicada pela coloração verde do explante. Entretanto, a alta porcentagem de sobrevivência dos segmentos nodais nem sempre podem ser usadas como indicativo de que haverá o estabelecimento de plantas a partir destes explantes. Muitas vezes os tecidos dos segmentos nodais continuam vivos (de coloração verde), no entanto, não emitem folhas ou brotos, isto é, não se estabelecem in vitro, o que pode ser justificado pelo grau de desenvolvimento da gema do explante.

7 % de Desenvolvimento min y = 1.019x R 2 = min 25 min y = x R 2 = y = x R 2 = min y = x R 2 = Período de Desenvolvimento (Dias) Figura 3. Desenvolvimento dos explantes de videira cv. Niagara Rosada em função do período de desenvolvimento em dias do cultivo in vitro após diferentes tempos de assepsia em hipoclorito de sódio (NaClO). Ipameri-GO, Figura 4. Explante com nota máxima de oxidação à esquerda; Explante com nota máxima de desenvolvimento à direita. Ipameri-GO, CONCLUSÃO Verificou-se que no processo de desinfestação dos explantes de videira cv. Niagara Rosada que a não contaminação dos explantes depende do processo de implantação do cultivo in vitro. O período de contato dos explantes com o hipoclorito de sódio (NaClO) não influencia o desenvolvimento e a oxidação dos explantes,

8 sendo recomendado o menor tempo de contato do explante com o hipoclorito de sódio, a fim de otimizar o processo e melhorar o estabelecimento in vitro. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ERIG, A.C.; SCHUCH, M.W. Estabelecimento in vitro de Mirtilo a partir de segmentos nodais. Scientia Agrária, v.6, n.1-2, p.91-96, GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropagação. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA/CBAB, p MONTARROYOS, A.V.V. Contaminação in vitro. ABCTP Notícias, Brasília, n.36 e 37, p.5-10, MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossay with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Kobenhavn, v.15, p , PASSOS, I. R. da S.; SONDAHL, M.R.; RIBEIRO, I.J.A.; TERRA, M.M.; PIRES, E.J.P. Cultura in vitro de meristemas de videira. I. Concentrações do hormônio 6-BA em meio primário. Bragantia, v.44, n.1, p , PEREIRA, J. E. S.; MATTOS, M. L. T.; FORTES, G. R. de L. Identificação e controle com antibióticos de bactérias endofíticas contaminantes em explantes de batata. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 38, n. 7, p , jul ROCHA, M.T.R. Cultura de tecidos: uma alternativa para a multiplicação dos gêneros Anthurium e Caladium p. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, ROSIER, J. P.; LOSSO, M. Cadeias produtivas do Estado de Santa Catarina: vitivinicultura. Florianópolis: Epagri, p. SCHUCK, E.; ANDRADE, E. R. de; GALLOTTI, G. J. M.; DAL BÓ, M. A. Novas alternativas na busca de soluções para o controle do declínio da videira. Revista Agropecuária Catarinense, Florianópolis, v. 6, n. 4, p , SOUZA, T.V.; ABREU, M. F.; TARAZI, R.; DANTAS, A.C.M.; OLIVEIRA, V.L.; PEDROTTI, E.L. Controle de contaminantes na cultura de tecidos em macieira (Mallus spp). In: Congresso brasileiro de floricultura e plantas ornamentais, 14. Congresso brasileiro de cultura de tecidos, 1., 2003, Lavras. Resumos... Lavras: UFLA/FAEPE, p.346. SILVA, A. L. da; SCHUCK, E.; HARISCAIN-LAFITTE, P.; PARIZZOTTO, A. Cultura in vitro do porta-enxerto de videira var resistente a fusariose. In: Simpósio brasileiro de melhoramento de frutíferas, 1., 1997, Jaboticabal. Anais... Jaboticabal: Unesp, p SILVA, A. L. da. Programa de certificação de mudas de videira em Santa Catarina. In: VITICULTURA e enologia: atualizando conceitos. Caldas: Epamig, p TEIXEIRA, J.B.; CRUZ, A.R.R.; FERREIRA, F.R.; CABRAL, J.R.S. Biotecnologia aplicada à produção de mudas. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, ano 3, n.19, 2001.