Controle da Contaminação in vitro de Explantes de Nim Indiano.

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1 Controle da Contaminação in vitro de Explantes de Nim Indiano. Giuseppe Serra Seca Vieira 1 ; Kicia Karinne Pereira Gomes 2 ; Ana da Silva Ledo 3 ; Arie Fitzgerald Blank 4 Bolsista FAP-SE e estagiário da Embrapa Tabuleiros Costeiros,CP. 44 CEP , Aracaju-SE; giuseppe@cpatc.embrapa.br Bolsista PIBIC/CNPq convênio Embrapa Tabuleiros Costeiros; kicia@cpatc.embrapa.br Eng. Agr., D. Sc. pesquisadora da Embrapa Tabuleiros Costeiros; analedo@cpatc.embrapa.br Professor da UFS-Departamento de Agronomia, Av. Marechal Rondon s/n CEP São Cristóvão-SE. arie.blank@terra.com.br RESUMO A assepsia do material vegetal é muito importante para a micropropagação, evitando a contaminação e, conseqüente, a perda do material vegetativo e do meio de cultura. O objetivo do presente trabalho foi de estabelecer um método eficiente de assepsia de explantes foliares e caulinares de nim indiano. Explantes caulinares e foliares, obtidos a partir de ramos de plantas adultas, foram submetidos aos diferentes tratamentos de assepsia: T 1 - testemunha; T 2 - solução de NaClO a 2% por 5 minutos sob agitação; T 3 - solução de NaClO a 2% por 10 minutos sob agitação; T 4 - solução de NaClO a 2% por 15 minutos sob agitação; T 5 - solução de NaClO a 2% por 20 minutos sob agitação. Todos os tratamentos foram constituídos de uma prévia imersão em álcool etílico a 70% por dois minutos. Após a assepsia os explantes foram inoculados em meio de cultura de Murashige e Skoog (MS). Foi avaliada a percentagem de explantes contaminados aos 8 dias após a inoculação. Todos os tratamentos, com exceção da testemunha, apresentaram 100% de eficiência na desinfestação dos explantes. Palavras-chave: Azadirachata indica A. Juss, azadirachtina, desinfestação, micropropagação ABSTRACT Control of the in vitro contamination of neem tree explants The desinfection of the explants is very important for the micropropagation, avoiding the contamination and the loss of the explants and culture medium. The objective of the present work was to establish an efficient desinfection method for the stem and leaf explants of neem tree. Stem and leaf explants, obtained from branches of adult plants, were submitted to the

2 different treatments: T 1 - control ; T 2 - immersion in a solution of 2% NaOCl for 5 minutes under agitation; T 3 - immersion in a solution of 2% NaOCl for 10 minutes under agitation; T 4 - immersion in a solution of 2% NaOCl for 15 minutes under agitation; and T 5 - immersion in a solution of 2% NaOCl for 20 minutes under agitation. All the treatments were constituted of an immersion in 70% ethyl alcohol for two minutes before the immersion in a sodium hypochloride solution. After desinfection the explants were inoculated in MS culture medium. The contamination percentage was evaluated at 8 days after the inoculation. All the treatments, except for the control, presented 100% of efficiency in the desinfection of the explants. Keywords: Azadirachata indica A. Juss, azadirachtin, desinfection, micropropagation O nim indiano (Azadirachta indica) é uma espécie arbórea da família Meliaceae, de origem asiática, muito resistente e de rápido crescimento, alcançando normalmente de 10 a 15m de altura. É originário do Sudeste da Ásia e cultivado em diversos países da Ásia, em todos os países da África, na Austrália, América do Sul e Central. É usado há séculos na Ásia, principalmente na Índia, como planta medicinal. Tem diversos outros usos, em especial como antisséptico, curativo e vermífugo (Martinez et al., 1998). Seu uso como inseticida se tornou bem conhecido nos últimos 30 anos, quando seu principal composto, a azadiractina, foi isolado. A molécula da azadiractina é muito complexa e ainda não pôde ser sintetizada; assim, todos os produtos que contêm azadiractina são produzidos utilizando-se o composto extraído da planta. Tais produtos possuem ação repelente, anti-alimentar, reguladora de crescimento, inseticida, acaricida, fungicida e nematicida. Os inseticidas naturais de nim são biodegradáveis e, por não deixarem resíduos tóxicos, conseqüentemente, não contaminam o ambiente. Os extratos de nim são mundialmente aprovados para uso em cultivos orgânicos (Martinez et al., 1998). A micropropagação é um dos mecanismos para a produção de compostos biologicamente ativos. Zypman et al. (1997), realizaram experimentos empregando métodos de cultura de tecidos de nim, para a produção de bioinseticida. A assepsia do material vegetal é de fundamental importância na micropropagação e, sendo efetuada com sucesso, evitará contaminação no meio de cultura por fungos e bactérias, que ocasionam perdas do material vegetativo e do meio de cultura (Rodrigues et al., 2003).

3 Segundo Scalize (2003), é necessário enorme cautela em relação a assepsia, desde o corte do material a campo até a câmara de fluxo laminar. Este trabalho teve o objetivo de estabelecer um protocolo de assepsia de explantes foliares e caulinares de nim indiano. MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram conduzidos no laboratório de biotecnologia vegetal da Embrapa Tabuleiros Costeiros. Os explantes utilizados foram segmentos caulinares e foliares, obtidos a partir de ramos jovens de plantas adultas. Os explantes foram lavados em água corrente por 10 minutos e submetidos ao procedimento de assepsia em câmara de fluxo laminar com a imersão em álcool etílico a 70% por dois minutos e, em seguida, imersos em solução de NaClO a 2% sob agitação em diferentes tempos: T 1 - testemunha (sem imersão em NaClO); T 2 -cinco minutos; T 3 - dez minutos; T 4 - quinze minutos; e T 5 - vinte minutos. Após a imersão em NaClO, os explantes foram lavados cinco vezes em água destilada e autoclavada. Os explantes foram inoculados em placas de petri com 10 ml de meio MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com 3% de sacarose e 0,6% de agar. O ph do meio MS foi ajustado para 5,8 e submetido à esterilização em autoclave a 120 C durante 15 minutos. As culturas foram mantidas em sala de crescimento sob escuro total, com temperatura de 26 C ± 2 e umidade relativa do ar em torno de 70%. O delineamento experimental de cada ensaio foi inteiramente casualizado, com cinco tratamentos e quatro repetições, sendo cada parcela experimental composta de uma placa de petri com seis explantes. Foi avaliada a percentagem de explantes contaminados aos 8 dias após a inoculação. Os dados foram transformados para x+1,0 e submetidos a analise de variância pelo teste F. RESULTADOS E DISCUSSÃO Conforme a análise de variância, não houve diferença significativa entre os tratamentos (Tabela 1) para a percentagem de contaminação aos 8 dias de cultura de segmentos caulinares e foliares de nim indiano. No tratamento onde a assepsia dos segmentos caulinares

4 e foliares foi realizada utilizando-se apenas lavagem em água estéril e imersão em álcool etílico a 70% observou-se 4,25% de contaminação de explantes. Quando se utilizou a imersão em solução dde NaClO a 2% tanto os explantes caulinares quanto as foliares apresentaram-se totalmente livres de contaminantes, independentemente do tempo de imersão. Estes resultados discordam dos obtidos por Scalize (2003), onde discos foliares apresentaram alta taxa de contaminantes, mesmo submetidos a assepsia com álcool 70% por 1minuto e imersão em solução de produto comercial de hipoclorito de sódio a 2,5%, alvejante comercial, a 20% (v/v) juntamente com uma gota de TWEEN 20, durante 20 minutos em agitação intermitente, e lavados com água destilada e estéril, sob condições de câmara asséptica. Isto pode ser explicado pelo fato de que diversos fatores, além da assepsia, podem influenciar no processo de contaminação de explantes, como por exemplo a época do ano de coleta de explantes. De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, recomenda-se a imersão dos explantes em solução de NaClO a 2% por cinco minutos. LITERATURA CITADA MARTINEZ, S.S.; LIMA, J. de; BOIÇA Jr., A.L. Avaliação agronômica e fitoquímica de neem, Azadirachta indica, de diferentes procedências em vários locais das regiões Sul e Sudeste do Brasil. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENTOMOLOGIA, 25., 1998, Rio de Janeiro. Resumos... Rio de Janeiro: Sociedade Entomológica do Brasil, p MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A Revised medium for rapid growth and biossays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p , RODRIGUES, T.M.; PAIVA, P.D. de O.; PAIVA, R.; PASQUAL, M. Assepsia de sementes de bromélia imperial para cultivo in vitro. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS, 1., Lavras. Anais... Lavras: ABCTP, p SCALIZE, F.E. Indução e detecção de azadirachtina em calos de Azadirachta indica Adr. Juss. (Nim) f. Tese (Mestrado em agronomia) - UNESP, Jaboticabal-SP.

5 ZYPMAN, S.; ZIV, M.; APPLEBAUM, S.; ALTMAN, U. Tissue culture methods and cloning of the neem tree (Azadirachata indica) for bioinsective production. Acta Horticulturae, Leuveni, p , Tabela 1. Resumo da análise de variância da percentagem de explantes contaminados de nim indiano em função de diferentes tratamentos de assepsia. Aracaju-SE, Fontes de GL SQ QM F Variação Tratamento 4 2,1029 0,5257 1,00 ns Erro 15 7,8860 0,5257 CV (%) 62,39 Ns- não significativo pelo teste F a 5% de significância. Tabela 2. Médias da percentagem de contaminação de segmentos de nim indiano em função de diferentes tratamentos de assepsia. Aracaju-SE, Tratamentos Contaminação (%) Segmentos Caulinares Segmentos Foliares Sem imersão em NaClO a 2% 4,25a 4,25a Imersão em NaClO a 2% por 5min. 0,00a 0,00a Imersão em NaClO a 2% por 10min. 0,00a 0,00a Imersão em NaClO a 2% por 15min. 0,00a 0,00a Imersão em NaClO a 2% por 20min. 0,00a 0,00a Médias seguidas de mesma letra na coluna, não diferem entre si pelo teste F a 5% de significância.