Assepsia e Estabelecimento in vitro. Prof. Paulo Hercílio Viegas Rodrigues

Transcrição

1 Assepsia e Estabelecimento in vitro Prof. Paulo Hercílio Viegas Rodrigues LPV-ESALQ

2 Assepsia Material Vegetal: Campo X Viveiro?

3 Assepsia Campo... Está em contato direto com esporos de fungos, insetos, pequenos animais e condição climática variável (umidade alta). Substrato ou solo rico em matéria orgânica e consequentemente de micro-organismos.

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5 Assepsia Viveiro... Está isolado do ambiente externo e com poucas variações climáticas. Normalmente utiliza-se substrato tratado.

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7 Assepsia Seleção do explante (material vegetal) Partes jovens da planta; Material sadio (visualmente). Teste para detecção de viroses e outras enfermidades. Phaelenopsis Rio Negro

8 Kits de Diagnóstico...

9 Assepsia Extração e Toalete do explante Tanto para extração como para o toalete, devemos utilizar instrumental apropriado e higienizado (pinças e facas esterilizaras e uso de hipoclorito entre uma planta e outra). Na extração cuidado para não danificar o explante; no toalete, retirar excesso de solo e partes vegetais para facilitar a pré-lavagem.

10 Banana

11 Assepsia Pré-lavagem do material vegetal. Lavar em água corrente, com esponja e detergente, a fim de retirar restos de solo, insetos fixados no tecido vegetal ou qualquer fonte de inóculo de fácil remoção.

12 Sujidade do tecido vegetal Conceito de sujidade! D-limoneno: adstringente natural que limpa superfície vegetal.

13 Assepsia Agentes químicos: - Álcool 70%; - Detergentes (Twin 20); - Produtos a base de Cloro (Ca(ClO)2; NaClO) com 2% de cloro ativo; - Produtos a base de Mercúrio (HgCl); - Óleos essenciais!!!!!

14 Assepsia Concentração das Soluções Assépticas (NaClO). Depende do tipo de tecidos vegetal: - Mais tenro (suave = 5 a 15% V/V) - Folhas, brotações jovens e tecidos tenros... - Consistência média (padrão = 20 a 30% V/V) - Ápices caulinares e ramos herbáceos... - Consistência dura (concentrado = 50% V/V) - Rizomas, ramos lenhosos e frutos/sementes...

15 Assepsia Tempo de assepsia: - 5 a 10 minutos; - Material tenro - 10 a 20 minutos; - Material consistência média - 20 a 30 minutos; - Material consistência dura

16 Assepsia Concentração X Tempo Resultados negativos!!!!! Variar concentração e tempo!!! Concentração Tempo (e vice-versa).

17 Assepsia Retirada da Solução e Lavagem dos explantes: O processo com solução asséptica é realizado no interior do fluxo laminar. Após o tempo pré determinado, a solução asséptica é drenada e devem ocorrer as lavagem com água destilada esterilizada. São realizadas 3 lavagens, ainda no interior do fluxo laminar.

18 Orquídeas!!

19 Quadro de amadurecimento da cápsula de sementes Gênero Bulbophylum 3 Calanthe 4 Cattleya 11 Coelogynes 13 Cymbidium 10 Cypripedum 3,5 Dendrobium 12 Epidendrum 3,5 Laelia 9 Masdevalia 3,5 Miltônia 9 Odontoglossum 7 Paphiopedilum 10 Phalaenopsis 6 Stanhopea 7 Wanda 20 Meses

20 Cápsula e sementes Orquídeas!

21 Protocolo de Assepsia (cápsula) Assepsia: hipoclorito comercial 50/50 (v/v), Tempo: 20 a 30 minutos, Lavagem 3 X com água autoclavada, Usar uma lâmina para abrir e outro instrumento para retirar as sementes.

22 Germinação in vitro...

23 Assepsia das sementes

24 Protocolo de Assepsia (sementes) Assepsia: hipoclorito comercial 30/70 (v/v), Tempo: 20 a 30 minutos, Lavagem 3 X com água autoclavada, Usar seringa ou gase nas lavagens, Filtro de café...

25 Kit Básico!!!

26 Germinação in vitro...

27 Peculiaridades!!! Lavar em água corrente por 30 minutos ou over night (cultura com endofíticos ou de difícil desinfecção). Empregar o sonicador para fase do hipoclorito. Utilizar fogo após a lavagem (rizoma banana). Incubar no escuro inicialmente. Uso de antibióticos no viveiro (explante) e no meio de cultivo.

28 Por Meristema Feito em híbridos Espécies de alta qualidade Processo com custo maior Cuidados com a planta (número de frentes)

29 Cultivo in vitro Phaelenopsis

30 Haste Floral (nós)

31 Álcool 70 % Assepsia 30 min. Solução de H2O2 (0,5 %) 15 min. Solução de H2O2 (3,0 %) Lavar com água destilada estéril (3x) OU 16.6 g/l dichloroisocyanuric acid Na2 (NaDCC) + Tween 20 (10 min) Lavar com água destilada estéril (3x)

32 A B

33 Oxidação

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37 A: Sigma Comercial (P6793) B: MS + Vitaminas de TS + cit C: B5 (Gamborg) + BAP D: B5 (Gamborg) E: Arditti & Ernst F: Arditti & Ernst + micro + aux + cit

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39 Cymbidium

40 Cattleya

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57 INSTALAÇÕES

58 PLANTAS PARA VENDA