Prof. Paulo Hercilio Viegas Rodrigues CEN-001
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- Manuella Caires Felgueiras
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1 Assepsia, estabelecimento e multiplicação in vitro Prof. Paulo Hercilio Viegas Rodrigues CEN-001
2 Assepsia Material Vegetal: Campo X Viveiro?
3 Assepsia Campo... Está em contato direto com esporos de fungos, insetos, pequenos animais e condição climática variável (umidade alta). Substrato ou solo rico em matéria orgânica e consequentemente de micro-organismos.
4 Assepsia Viveiro... Está isolado do ambiente externo e com poucas variações climáticas. Normalmente utiliza-se substrato tratado.
5 Assepsia Seleção do explante (material vegetal) Partes jovens da planta; Material sadio (visualmente). * Teste para detecção de viroses e outras enfermidades.
6 Assepsia Extração e Toalete do explante Tanto para extração como para o toalete, devemos utilizar instrumental apropriado e higienizado (pinças e facas esterilizaras e uso de hipoclorito entre uma planta e outra). Phaelenopsis Rio Negro Na extração cuidado para não danificar o explante; no toalete, retirar excesso de solo e partes vegetais para facilitar a pré-lavagem.
7 Assepsia Pré-lavagem do material vegetal. Lavar em água corrente, com esponja e detergente, a fim de retirar restos de solo, insetos fixados no tecido vegetal ou qualquer fonte de inóculo de fácil remoção.
8 Assepsia Agentes químicos: - Álcool 70%; - Detergentes (Twin 20); - Produtos a base de Cloro (Ca(ClO)2; NaClO) com 2% de cloro ativo; - Produtos a base de Mercúrio (HgCl); - Óleos essenciais!!!!!
9 Assepsia Concentração das Soluções Assépticas (NaClO). Depende do tipo de tecidos vegetal: - Mais tenro (suave = 5 a 15% V/V) - Folhas, brotações jovens e tecidos tenros... - Consistência média (padrão = 20 a 30% V/V) - Ápices caulinares e ramos herbáceos... - Consistência dura (concentrado = 50% V/V) - Rizomas, ramos lenhosos e frutos/sementes...
10 Assepsia Tempo de assepsia: - 5 a 10 minutos; - Material tenro - 10 a 20 minutos; - Material consistência média - 20 a 30 minutos; - Material consistência dura
11 Assepsia Concentração X Tempo Resultados negativos!!!!! Variar concentração e tempo!!! Concentração Tempo (e vice-versa).
12 Assepsia Retirada da Solução e Lavagem dos explantes: O processo com solução asséptica é realizado no interior do fluxo laminar. Após o tempo pré determinado, a solução asséptica é drenada e devem ocorrer as lavagem com água destilada esterilizada. São realizadas 3 lavagens, ainda no interior do fluxo laminar.
13 Abacaxi Retirar as folhas da coroa até expor as gemas; Lavar em água corrente (esponja e detergente levemente); Excisar as gemas da coroa formando uma base triangular na gema e colocar em um becker; Álcool 70% por 30 segundos; Hipoclorito comercial (Q-boa) 3:1 ou 25% V/V por 15 minutos. Lavar 3 vezes e introduzir em meio líquido; Incubar por 30 a 45 dias em sala de crescimento.
14 Banana Lavar os rizomas em água corrente (retirada de solo); Com faca ou facão reduzir o rizoma a uma estrutura de 3 a 5 cm de Ø por 8 a 10 cm de comprimento (manter a forma cilindrica). Colocar os rizomas em um becker e adicionar álcool 70% por 1 minuto; Hipoclorito comercial (Q-boa) 50% V/V por vinte minutos; Com auxílio de pinça e bisturi reduzir a uma estrutura cilíndrica de 0,5 cm de Ø por 1,5 cm de comprimento; Introduzir em meio semi-sólidosólido e incubar por 21 a 28 dias em sala de crescimento.
15 Banana
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20 Banana
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25 Bambu (China) Métodos de assepsia: Cortar o ramo inteiro, talvez com 1 m de comprimento. Cortar em pequenas secções de 3 a 5 cm de comprimento, contendo 1 nó em cada secção Lavar em água com detergente um a um cada explante com a ajuda de um pincel Lavar em água corrente por aproxidamente 30 minutos No fluxo laminar, desinfecção em HgCl 0,1% por 3 minutos Lavar 5 vezes em água esterilizada Transferir para o meio de cultura sem cortar as pontas Permanecer no escuro durante 10 dias, ate os brotos atingirem 3 cm de comprimento. Somente após este período transferir par a luz.
26 Peculiaridades!!! Lavar em água corrente por 30 minutos ou over night (cultura com endofíticos ou de difícil desinfecção). Empregar o sonicador para fase do hipoclorito. Utilizar fogo após a lavagem (rizoma banana). Incubar no escuro inicialmente. Uso de antibióticos no viveiro (explante) e no meio de cultivo.
27 Estabelecimento in vitro Depende dos seguintes fatores: Qualidade do explante; Eficiência da Assepsia; Capacidade da cultura em se desenvolver in vitro (adaptar ao sistema in vitro).
28 Multiplicação...
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