Prof. Paulo Hercilio Viegas Rodrigues CEN-001

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1 Assepsia, estabelecimento e multiplicação in vitro Prof. Paulo Hercilio Viegas Rodrigues CEN-001

2 Assepsia Material Vegetal: Campo X Viveiro?

3 Assepsia Campo... Está em contato direto com esporos de fungos, insetos, pequenos animais e condição climática variável (umidade alta). Substrato ou solo rico em matéria orgânica e consequentemente de micro-organismos.

4 Assepsia Viveiro... Está isolado do ambiente externo e com poucas variações climáticas. Normalmente utiliza-se substrato tratado.

5 Assepsia Seleção do explante (material vegetal) Partes jovens da planta; Material sadio (visualmente). * Teste para detecção de viroses e outras enfermidades.

6 Assepsia Extração e Toalete do explante Tanto para extração como para o toalete, devemos utilizar instrumental apropriado e higienizado (pinças e facas esterilizaras e uso de hipoclorito entre uma planta e outra). Phaelenopsis Rio Negro Na extração cuidado para não danificar o explante; no toalete, retirar excesso de solo e partes vegetais para facilitar a pré-lavagem.

7 Assepsia Pré-lavagem do material vegetal. Lavar em água corrente, com esponja e detergente, a fim de retirar restos de solo, insetos fixados no tecido vegetal ou qualquer fonte de inóculo de fácil remoção.

8 Assepsia Agentes químicos: - Álcool 70%; - Detergentes (Twin 20); - Produtos a base de Cloro (Ca(ClO)2; NaClO) com 2% de cloro ativo; - Produtos a base de Mercúrio (HgCl); - Óleos essenciais!!!!!

9 Assepsia Concentração das Soluções Assépticas (NaClO). Depende do tipo de tecidos vegetal: - Mais tenro (suave = 5 a 15% V/V) - Folhas, brotações jovens e tecidos tenros... - Consistência média (padrão = 20 a 30% V/V) - Ápices caulinares e ramos herbáceos... - Consistência dura (concentrado = 50% V/V) - Rizomas, ramos lenhosos e frutos/sementes...

10 Assepsia Tempo de assepsia: - 5 a 10 minutos; - Material tenro - 10 a 20 minutos; - Material consistência média - 20 a 30 minutos; - Material consistência dura

11 Assepsia Concentração X Tempo Resultados negativos!!!!! Variar concentração e tempo!!! Concentração Tempo (e vice-versa).

12 Assepsia Retirada da Solução e Lavagem dos explantes: O processo com solução asséptica é realizado no interior do fluxo laminar. Após o tempo pré determinado, a solução asséptica é drenada e devem ocorrer as lavagem com água destilada esterilizada. São realizadas 3 lavagens, ainda no interior do fluxo laminar.

13 Abacaxi Retirar as folhas da coroa até expor as gemas; Lavar em água corrente (esponja e detergente levemente); Excisar as gemas da coroa formando uma base triangular na gema e colocar em um becker; Álcool 70% por 30 segundos; Hipoclorito comercial (Q-boa) 3:1 ou 25% V/V por 15 minutos. Lavar 3 vezes e introduzir em meio líquido; Incubar por 30 a 45 dias em sala de crescimento.

14 Banana Lavar os rizomas em água corrente (retirada de solo); Com faca ou facão reduzir o rizoma a uma estrutura de 3 a 5 cm de Ø por 8 a 10 cm de comprimento (manter a forma cilindrica). Colocar os rizomas em um becker e adicionar álcool 70% por 1 minuto; Hipoclorito comercial (Q-boa) 50% V/V por vinte minutos; Com auxílio de pinça e bisturi reduzir a uma estrutura cilíndrica de 0,5 cm de Ø por 1,5 cm de comprimento; Introduzir em meio semi-sólidosólido e incubar por 21 a 28 dias em sala de crescimento.

15 Banana

16 Banana

17 Banana

18 Banana

19 Banana

20 Banana

21 Banana

22 Banana

23 Banana

24 Banana

25 Bambu (China) Métodos de assepsia: Cortar o ramo inteiro, talvez com 1 m de comprimento. Cortar em pequenas secções de 3 a 5 cm de comprimento, contendo 1 nó em cada secção Lavar em água com detergente um a um cada explante com a ajuda de um pincel Lavar em água corrente por aproxidamente 30 minutos No fluxo laminar, desinfecção em HgCl 0,1% por 3 minutos Lavar 5 vezes em água esterilizada Transferir para o meio de cultura sem cortar as pontas Permanecer no escuro durante 10 dias, ate os brotos atingirem 3 cm de comprimento. Somente após este período transferir par a luz.

26 Peculiaridades!!! Lavar em água corrente por 30 minutos ou over night (cultura com endofíticos ou de difícil desinfecção). Empregar o sonicador para fase do hipoclorito. Utilizar fogo após a lavagem (rizoma banana). Incubar no escuro inicialmente. Uso de antibióticos no viveiro (explante) e no meio de cultivo.

27 Estabelecimento in vitro Depende dos seguintes fatores: Qualidade do explante; Eficiência da Assepsia; Capacidade da cultura em se desenvolver in vitro (adaptar ao sistema in vitro).

28 Multiplicação...

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