AF060 Biotecnologia Vegetal

Transcrição

1 AF060 Biotecnologia Vegetal Professores responsáveis: Prof. João Carlos Bespalhok Filho Prof. Luiz Antonio Biasi Profa. Renata Faier Calegario Prof. Bruno Portela Brasileiro Profa. Daniella N. M. Carneiro Doutoranda: Carolina S. Schuchovski Augusto

2 Cultura de Tecidos Vegetais v Tópicos: v Organização do laboratório v Meios de Cultura (componentes e preparo) v Assepsia v Organogênese v Embriogênese

3 Organização do laboratório

4 Finalidade do laboratório v Pesquisa: v Estudo de diversas técnicas, variedade de espécies trabalhadas, ensino

5 Finalidade do laboratório v Comercial: v Biofábricas: produção em larga escala, eficiência, custo reduzido

6 Técnicas uvlizadas v Micropropagação v Cultura de meristemas: ápices meristemávcos livres de vírus v Transformação genévca: introdução de uma sequência definida de DNA v Cultura de óvulos: haploides v Cultura de embriões zigóvcos (resgate de embriões): superar a dormência das sementes, estudo do desenvolvimento do embrião, recuperar híbridos raros de cruzamentos incompayveis v Protoplastos: células sem parede celular, estudos no melhoramento genévco

7 Mudas micropropagadas v Vantagens e desvantagens Alto custo; Mão de obra especializada; Alto custo de materiais Contaminação; Oxidação; Grande nº de mudas; Controle das condições de trabalho; Livres de doenças; Crescimento rápido; MulVplicar plantas que não produzem ou produzem poucas sementes.

8 Etapas do processo in vitro v Estabelecimento in vitro v Desenvolvimento do explante, seguindo a rota escolhida v Transferência das plantas para o ambiente externo

9 Etapas do processo in vitro

10 CarcaterísVcas importantes v Ambiente assépvco v Temperatura e iluminação controlados

11 Estrutura básica v Sala de limpeza v Sala de preparo de meio v Sala de transferência v Sala de crescimento v Outras dependências

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13 Estrutura de apoio v Casa de vegetação v Câmara de nebulização v Temperatura controlada v Telado

14 v Sala de limpeza Estrutura básica v Descarte meio de cultura v Lavagem de vidraria v Autoclavagem de água e meio de cultura

15 Estrutura básica v Sala de limpeza

16 v Sala de limpeza Estrutura básica v Pias fundas v Locais para armazenar vidros sujos v Lavagem v Detergente v Hipoclorito de sódio (NaClO) v Estufa para secagem v Descarte de material v Produtos químicos e meio de cultura

17 Estrutura básica v Sala de preparo de meio v Preparo de soluções e meios de cultura

18 Estrutura básica v Sala de transferência v Local de manipulação assépvca das culturas

19 Estrutura básica v Sala de transferência

20 Estrutura básica v Sala de crescimento

21 Estrutura básica v Sala de crescimento

22 Estrutura básica v Sala de crescimento v Prateleiras v Lâmpadas v Timer v Luminosidade - 16 h v Temperatura controlada: v Ar condicionado: 23 ºC ± 2ºC

23 Estrutura de apoio v Casa de vegetação v Câmara de nebulização e climavzada

24 Estrutura de apoio v Casa de vegetação v Câmara de nebulização e climavzada

25 v Telado Estrutura de apoio

26 v Autoclave: Equipamentos v Esterilização a 121ºC e pressão 1,05km/cm 2

27 v Autoclave: Equipamentos v Manuais, automávcas v Horizontais, VerVcais

28 v Deionizador: v Remoção: v Minerais Equipamentos v íons nas resinas v Não remove substâncias orgânicas

29 v DesVlador: v Remoção de: v Minerais Equipamentos v Subst. orgânicas v Aquecer, ferver, evaporar, condensar e coletar

30 v Ultra-purificador sistema MilliQ: Equipamentos v Resinas eficientes para remoção minerais v ReVrada de paryculas orgânicas (filtro de membrana 0,22 µm)

31 Equipamentos v Forno de Microondas:

32 Equipamentos v Estufa de secagem: v Forno elétrico comum v Secagem de vidaria

33 Equipamentos v Geradores de eletricidade e estabilizadores de voltagem: v GaranVa de fornecimento ininterrupto de eletricidade v Proteção aos aparelhos

34 Equipamentos v Refrigerador e freezer: v Soluções estoque, Reguladores de crescimento, Vitaminas, Material vegetal

35 v Balança: Equipamentos v Macronutrientes, precisão 0,1g v Balança de precisão: v Alto custo; precisão de 0,1mg

36 v Agitador magnévco Equipamentos

37 v Medidor de ph: Equipamentos v Calibração periódica com soluções estoque

38 Equipamentos v Câmara de fluxo laminar:

39 Equipamentos v Câmara de fluxo laminar: v Imprescindível para os trabalhos de manipulação assépvca

40 v Câmara de fluxo laminar: v Ar passa por um filtro bacteriológico v Ambiente com pressão posivva Equipamentos

41 Equipamentos v Câmara de fluxo laminar com luz ultravioleta: v Ligar 20 minutos antes v Desligar a luz v Não permanecer na sala v Queimaduras v Altamente mutagênica

42 Equipamentos v Dispensador de meio de cultura:

43 v Microscópio estereoscópico: Equipamentos

44 v Agitador orbital: Equipamentos

45 Equipamentos v Lamparina de álcool ou bico-de-bunsen

46 v Micropipetas Equipamentos

47 v Ar-condicionado Equipamentos

48 Equipamentos v Biorreatores de imersão temporária

49 Equipamentos v Biorreatores de imersão temporária: v MulVplicação em larga escala

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51 v Fotografia: Equipamentos

52 v Frascos de cultura: Utensílios

53 Utensílios v Suportes para tubos de ensaio v Pinças, bisturis v Bandejas v Frascos para água e para reagentes v Béquer, erlenmeyer, proveta, pipeta, placa de petri v Outros materiais: papel toalha, alumínio, filme plásvco, evquetas

54 Segurança em laboratório v Regras a serem rigorosamente seguidas v Evitar acidentes v Evitar prejuízos humanos e materiais

55 Segurança em laboratório v Uso de guarda-pó de algodão v Uso de calçados fechados v Lavar as mãos com detergente antes do início dos trabalhos v Laboratório sempre fechado e limpo v Não comer e não beber no laboratório

56 Segurança em laboratório v Nunca usar material e utensílios do laboratório para comer ou para beber v Substâncias inflamáveis devem ser manipuladas longe de fontes de aquecimento v Sempre que usar pipetas, uvlizar pipetadores

57 Segurança em laboratório v Antes de manipular qualquer reagente, informar-se sobre a toxicidade, inflamabilidade e explosividade do mesmo v Cuidados especiais ao manipular substâncias com potencial carcinogênico v Usar os EPIs adequados: guarda-pó, luvas, máscaras, óculos de segurança

58 Segurança em laboratório v Reagentes e soluções: v Claramente idenvficados v Concentração v Responsável pelo preparo v Data do preparo v Todas as substâncias são tóxicas dependendo da sua concentração

59 Segurança em laboratório v Cuidados no manuseio de equipamentos: v CerVficar-se sempre da voltagem correta v Ler as instruções de uso v Em caso de dúvida, perguntar ao técnico responsável

60 Segurança em laboratório v Cuidados: v Corte com vidros quebrados ou bisturi v Queimaduras com material da autoclave v Incêndio com álcool (lamparina ou assepsia)

61 Organização do trabalho v Caderno de laboratório v Fonte de informações v Tentar descrever ao máximo as avvidades v Deve ficar no laboratório

62 Organização do trabalho v Espaço mulv usuário v Necessidade de programação para: v Preparo de meio v Autoclavagem v Câmara de fluxo laminar

63 Segurança em laboratório v Biossegurança: v Conjunto de medidas de segurança v CTNBio (Comissão técnica de biossegurança nacional) v hop://ctnbio.mcv.gov.br v OGMs

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65 Segurança em laboratório v Biossegurança: v CIBio (comissão interna de biossegurança) CQB: 0114/99 Setor de Ciências Agrárias - UFPR CNPJ: / ENDEREÇO: Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo - Rua dos Funcionários, 1540 CIDADE: CuriVba UF: PR CEP: TELEFONES: (41) FAX: (41) PRESIDENTE: João Carlos Bespalhok Filho bespa@ufpr.br MEMBROS: Flávio Zaneoe; Francine Lorena Cuquel; Marguerite G. G. Quorin ; Luiz Antônio Biasi OBSERVAÇÕES:

66 Segurança em laboratório v Biossegurança: v CQB CerVficado de Qualidade em Biossegurança v credenciamento que a CTNBio concede às insvtuições para desenvolver projetos com Organismos GeneVcamente Modificados (OGM) Processo: / Protocolo: 23/07/1999 CQB: 0114/99 InsVtuição: Setor de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Paraná - UFPR Situação CQB: ATIVO Responsável Legal: Luiz Antonio Biasi Finalidade: ENSINO;PESQUISA EM REGIME DE CONTENÇÃO AVvidades: PLANTAS;MICROORGANISMOS

67 Meio de Cultura

68 Componentes v v v v v v v v Água Macronutrientes Micronutrientes Vitaminas Carboidratos Reguladores do crescimento Ágar ou outros gelificantes ph

69 v Macronutrientes: v Nitrogênio (N) v Fósforo (P) v Potássio (K) v Cálcio (Ca) v Magnésio (Mg) v Enxofre (S) Componentes

70 v Micronutrientes: v Ferro (Fe) v Manganês (Mn) v Zinco (Zn) v Boro (Bo) v Cobre (Cu) v Molibdênio (Mo) v Outros v Cobalto e Iodo Componentes

71 v Vitaminas e Inositol v Tiamina v Ácido NicoYnico v Piridoxina v Glicina v Mio Inositol Componentes

72 v Carboidratos v Sacarose Componentes

73 Componentes v Reguladores do crescimento v Auxinas v AIA, AIB, 2,4-D, ANA v Citocininas v CIN, BAP, TDZ, 2iP, Zea v Giberelinas v GA3 v Ácido Abscísico v ABA

74 Componentes v Agentes gelificantes v Ágar v 6 a 10 g/l v Gelrite/phytagel v 1 a 2 g/l

75 v ph Componentes v Deve ficar na faixa de 5 a 5,8 v Ajustar ph adicionando solução de NaOH (base) ou HCl (ácido) v ph influencia: v Disponibilidade de nutrientes v Consistência do gel

76 Meio MS v Murashige e Skoog (1962) v Mais uvlizado na cultura de tecidos v Rico em nitrogênio

77 Meio MS - composição

78 Preparo v Soluções estoque: preparo e armazenamento

79 Preparo v Preparo do meio de cultura v Adição das soluções estoque v Completar o volume desejado com água v Adição da sacarose, mio inositol v Adição do regulador de crescimento v Controle do ph v Adição de ágar e solubilização v Distribuição nos frascos, fechamento v Autoclavagem do meio

80 Assepsia

81 Assepsia v Eliminação de microorganismos presentes no tecido vegetal, mediante aplicação de agentes químicos e ~sicos, sem danificar estes tecidos.

82 Assepsia

83 Assepsia v Lavagem com água corrente

84 Assepsia v Imersão: v Hipoclorito de Sódio (NaClO) v Etanol v Cloreto de Mercúrio (HgCl2) v Detergentes (Twin 20) v Dentro da câmara

85 Assepsia v Lavagem com água esterilizada (dentro da câmara de fluxo laminar)

86 Assepsia v As concentrações variam de acordo com o tempo que o material será exposto ao produto Concentração Tempo

87 Assepsia da Amora-preta v Exemplo experimento de assepsia v v v v v v segmentos nodais 1,5 cm solução etanol (70%) + Tween 20 (0,1%): 30 segundos tratamentos: v sem imersão em hipoclorito de sódio (0,5%) (testemunha) v 10 minutos de imersão em NaOCl (0,5%) v 20 minutos de imersão em NaOCl (0,5%) v 30 minutos de imersão em NaOCl (0,5%) 3 lavagens em água deionizada e esterilizada meio MS + 5 µm BAP duração: 60 dias

88 Assepsia da Amora-preta TRATAMENTOS NÚMERO DE OBSERVAÇÕES (nº) CONTAMINAÇÃO (%) Sem imersão 60 96,7b (1) 10 minutos 60 83,3a 20 minutos 60 78,3a 30 minutos 60 66,7a Coeficiente de variação (%) 11,78 (1) Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem estatisticamente entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

89 Rotas Morfogênicas

90 Rotas Morfogênicas v Organogênese v Formação de um órgão v Embriogênese v Formação de um embrião

91 Organogênese

92 Organogênese v Processo de formação de um órgão a parvr de um tecido v Gema/ Broto v Raiz

93 v Direta Direta ou Indireta v Sem formação de calo v Indireta v Formação de calo (massa celular não diferenciada)

94 Fatores que afetam a organogênese v Espécie/genóVpo v Explante v Juvenil x Maduro v Meio de cultura v Regulador de crescimento v Tipo e concentração v Gemas: citocininas (BAP, cinevna) v Formação de raízes: auxinas

95 Aplicações da organogênese v Micropropagação v Organogênese direta v Transformação genévca

96 Embriogênese somávca

97 Embriogênese somávca v Processo de formação de um embrião a parvr de um tecido somávco v Embrião somávco é bipolar v Ápice caulinar v Radicular

98 Embriogênese somávca v Embriogênese direta v Sem formação de calo

99 Embriogênese somávca v Embriogênese indireta v Com formação de calo

100 Estágios de desenvolvimento v Globular, cordiforme, torpedo e covledonar

101 Estágios de desenvolvimento v Indução (indireta) v Auxinas (2,4-D) desdiferenciação formação do calo embriogênico v Formação do embrião v ReVrada/Diminuição da concentração de auxinas

102 v Espécie/genóVpo v Explante v Meio de cultura Fatores que afetam v Alta concentração de sais, principalmente Nitrogênio v Luz v Indução geralmente é feita no escuro

103 Aplicações v Sementes sintévcas v Transformação genévca

104 Muito obrigada!