PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO PADRÃO - POP

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1 1. OBJETIVO PÁG.: 1/7 Definir um procedimento para a análise de coliformes totais e termotolerantes pela técnica de membrana filtrante. 2. ALCANCE Este procedimento se aplica a análise de coliformes pelo Laboratório de Controle de Qualidade Microbiológico. 3. POLÍTICA É política da empresa cumprir com as Boas Práticas de Laboratório. 4. RESPONSABILIDADES É responsabilidade da Chefia de departamento e da Chefia de setor orientar seus funcionários para a correta execução deste procedimento. É responsabilidade dos funcionários do Controle de Qualidade Microbiológica cumprirem com o estabelecido neste procedimento. É responsabilidade de quem o elabora e de quem o revisa atualizar e manter vigente este procedimento. 5. DEFINIÇÕES Coliformes totais: bacilos Gram - negativos, oxidase negativos, capazes de crescer na presença de sais biliares ou agentes tensoativos (como lauril sulfato de sódio) e de fermentar a lactose a C, com produção de gás e aldeído, em 24 horas. A maior parte das bactérias do grupo coliforme pertencem aos gêneros Escherichia, Klebsiela, Enterobacter e Citrobacter. Podem ocorrer no meio ambiente, fezes humanas, em águas com alta concentração de matéria orgânica, solo ou vegetação em decomposição. Coliformes termotolerantes( ou fecais): microorganismos capazes de fermentar a lactose a C sendo representados principalmente pela Escherichia coli (fecal), e algumas bactérias dos gêneros Klebsiela, Enterobacter e Citrobacter. Somente Escherichia coli dentre estes microorganismos é de origem exclusivamente fecal, estando presente em densidades elevadas nas fezes humanas,

2 PÁG.: 2/7 mamíferos e pássaros, sendo raramente encontrada na água ou no solo que não tenham recebido contaminação fecal. Os demais, podem estar presentes com alto teor de matéria orgânica (efluentes industriais), ou em material vegetal ou solo em decomposição. 6. MATERIAL E EQUIPAMENTO - alça plástica estéril (loop) - bandejas de plástico ou aço inox - béquer 50mL, 100mL - bico de Bunsen ou similar - bolsas plásticas para coleta das amostras 120 ml - bomba à vácuo - caixa para esterilização de ponteiras - cilindros inox para esterilização de placas de Petri - equipamento ou sistema de filtração - estantes de inox para tubos de ensaio - estantes revestidas de PCV para bolsa plástica de coleta - estojo inox para esterilização de pipetas - frascos para água de lavagem 100mL, 250mL, 300mL, 500mL, 1000mL - frascos para coleta das amostras de 250mL - hastes de madeira esterilizadas - incubadora bacteriológica ( 35 C ± 2 C) - micropipetador 100 a 1000µL - microscópio estereoscópico binocular, com iluminação fluorescente - papel alumínio - pinças de aço inox com extremidades arredondadas - pipetas graduadas de 1mL, 5mL - placas de Petri 60 x 15 mm - placas de Petri descartáveis 60 x 15 mm - ponteiras universais 100 a 1000µL - provetas graduadas de 100mL, 250mL - membranas filtrante estéreis, brancas, quadriculadas, com 47 mm de diâmetro e porosidade 0,45µm (para a determinação de coliformes totais) 6.1. Reagentes - água destilada estéril, confrome CMI água fosfatada uso esterilizada, conforme CMI álcool etílico 95%

3 PÁG.: 3/7 - álcool etílico a 70% - caldo EC Medium preparado conforme CMI caldo lactose ou caldo lauril sulfato com púrpura de bromocresol, concentração simples, conforme CMI caldo verde brilhante com 2% de bile, confome CMI placas de Petri contendo o meio M-Endo Agar Les preparadas conforme CMI testes descartáveis com o meio M-Endo (Nutrient pad sets) - tiossulfato de sódio 1,8% 7. DIAGRAMA DE FLUXO

4 Amostra PÁG.: 4/7 Filtração M-Endo Agar Les 35 C / 24 horas Colonias típicas (com brilho metálico) Ausência de colônia teste negativo p/ coliformes Lactose / Lauril Sulfato 24h-48h/ 35ºC Colônias atípicas Ausência de coliformes Produção de gás Ausência de gás Teste negativo para coliformes Caldo Verde Brilhante e Bile 35 C / 24h -48h Meio EC 44,5ºC / 24h Produção de gás Teste positivo totais Ausência de gás Teste negativo totais Produção de gás Teste positivo termotolerantes Ausência de gás Teste negativo termotolerantes

5 8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparação: 8.2. Análise: PÁG.: 5/ Antes de iniciar a análise desinfete a bancada de trabalho com álcool a 70% Disponha na bancada de trabalho o equipamento de filtração com porta filtro, placas de Petri de de 60 x 15 mm contendo meio M-Endo Agar Les (para determinação de coliformes totais), identifique-as com o número da amostra ou a identificação da amostra e a data, disponha também a água de lavagem estéril, contida em frascos, para enxágüe, pinças com as extremidades arredondadas, podendo flambá-las com álcool etílico contido em um béquer. Deixe próximo também as membranas filtrantes estéreis, brancas, quadriculadas, com 47 mm de diâmetro e porosidade de 0,45µm. Os bicos de Bunsen, acesos próximos, permitem manter um ambiente asséptico e efetuar a flambagem das pinças utilizadas. NOTA: Esta análise pode ser realizada em câmara de segurança biológica classe II sem o uso de bico de Bunsen, as pinças estéreis, se disponíveis em número suficiente, podem ser utilizadas individualmente por ponto de coleta Quando utilizadas as placas de testes descartáveis com o meio M-Endo (Nutrient pad sets), disponha na bancada as placas, água destilada estéril, pipetas, pêra ou ponteiras e micropipetador para hidratá-las. A hidratação deve seguir as orientações do fornecedor. Não inverta estas placas para a incubação Homogenize a amostra, no mínimo 25 vezes, inclinando o frasco até formar um ângulo de 45 entre o braço e o antebraço, e coloque 100 ml de água a ser filtrada. NOTA: Caso o porta filtro não seja graduado, há necessidade de dosagem prévia do volume a ser filtrado, nesta situação utilize uma proveta graduada estéril (100 ml), com a abertura recoberta pelo papel alumínio da esterilização, e marque o filtro para as próximas amostras Retire a parte superior do porta-filtro e, com uma pinça flambada e esfriada, coloque, na base do suporte do filtro, uma membrana estéril, com a face quadriculada voltada para cima Recoloque a parte superior do porta filtro, tendo o cuidado para não danificar a membrana. Ajuste e rosqueie Verta cuidadosamente no porta-filtro o volume da amostra a ser examinado, evitando que a água respingue nas paredes do filtro. NOTA: Se o volume da amostra a ser filtrado for inferior a 20 ml, é necessário adicionar ao porta-filtro 20 ml a 30 ml de água de diluição estéril, antes de adicionar o volume da amostra Proceda à filtração da amostra, ligando a bomba à vácuo Enxágüe a membrana com porções de 20 a 30 ml de água de diluição estéril Desligue a bomba à vácuo, ao finalizar a operação. Evite a secagem excessiva da membrana filtrante.

6 PÁG.: 6/ Com o auxílio da pinça flambada e fria, retire a membrana do filtro, tomando o cuidado para que a pinça toque apenas a parte periférica da membrana Obedecendo aos cuidados de assepsia, coloque a membrana sobre o meio de cultura M- Endo Agar Les, evite a formação de bolhas de ar entre a membrana e o meio de cultura, pois pode prejudicar o crescimento das colônias de bactérias Lave o filtro com 20 a 30 ml de água de diluição, antes de colocar a próxima membrana para filtrar outra amostra. NOTA: Cada unidade de filtração deve ser usada até no máximo para 30 amostras de água, sucessivamente. Quando o intervalo, entre uma amostra e outra, ultrapassar 30 minutos, usar nova unidade de filtração Após a filtração das amostras, coloque as placas em posição invertida, em bandejas forradas com papel toalha umedecido Incube as placas, em estufa de incubação, a 35º ± 2 C por horas Após a incubação, faça a leitura das amostras Resultados: Uma placa que não apresente formação de colônias na membrana significa ausência para coliformes totais Uma placa que apresente formação de colônias atípicas (incolores até vermelho escuras, sem brilho metálico em sua superfície), ausência de coliformes totais Uma placa que apresente formação de colônias típicas (de coloração rosa a vermelho escuro, com brilho verde metálico superficial recobrindo toda colônia ou parte dela), presença de coliformes totais Para confirmar se dentre estes coliformes totais existem coliformes termotolerantes proceda à confirmação das colônias Confirmação da presença de termotolerantes: Passe o inóculo da placa com colônias típicas para o caldo lactosado, incube por 24 a 48 horas a 35º + 2 C Na ausência de formação de gás o teste é negativo para coliformes Se houve produção de gás passe o inóculo do caldo lactosado para o meio EC e incube a 44,5º C por 24 horas, passe o inoculo do caldo lactosado para o meio Verde Brilhante e Bile e incube por 24 a 48 horas a 35º C No caldo verde brilhante e bile: se houve produção de gás o teste é positivo para coliformes totais, na ausência de gás o teste é negativo para coliformes totais.

7 PÁG.: 7/ No caldo EC: se houve produção de gás o teste é positivo para coliformes termotolerantes, na ausência de gás o teste é negativo para coliformes termotolerantes. 9. ANEXOS Não se aplica. 10. BIBLIOGRAFIA Procedimento elaborado pelo Controle de Qualidade Microbiológico da ETA Cerrado do SAAE Sorocaba de acordo com o manual: CETESB Técnicas de Análises Microbiológicas da água Membrana Filtrante. São Paulo, 2001.