Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra. Método do Número Mais Provável

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1 Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra MICROBIOLOGIA António Verissimo Paula Morais Método do Número Mais Provável Introdução O método do NMP permite calcular o número de um microorganismo específico numa amostra de água, utilizando tabelas de probabilidade. Diluições decimais da amostra são inoculadas em séries de tubos contendo meio líquido selectivo. Os tubos são positivos quando têm crescimento e/ou produção de gás de fermentação. A densidade bacteriana é determinada pela combinação de resultados positivos e negativos numa tabela designada por tabela do NMP. Este método é constituído por três testes: - Teste Presuntivo - Teste Confirmativo - Teste Completo. O Teste Presuntivo fornece uma estimativa preliminar da densidade do grupo bacteriano baseada no enriquecimento em meio minimamente restritivo. Os resultados deste teste não podem ser usados sem confirmação posterior. O Teste Confirmativo é a segunda fase do NMP. Os tubos considerados positivos no teste anterior são inoculados em tubos de meio mais selectivo e inibidor. As reacções positivas são lidas e a densidade calculada com a ajuda da tabela NMP. O Teste Completo é a terceira etapa. É utilizada apenas na determinação do número de coliformes totais. Os tubos positivos do teste anterior são submetidos a testes adicionais para isolamento e identificação dos microorganismos. Devido à morosidade deste teste, ele não é normalmente utilizado. 1

2 Definição dos grupos indicadores de contaminação Coliformes - Este grupo também designado por coliformes totais inclui todas as bactérias Gram negativas, aeróbias facultativas, capazes de fermentar lactose, com produção de gás, em h a 35 C. A definição inclui os géneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. Coliformes fecais - São parte do grupo dos coliformes totais e incluem bactérias Gram negativas, facultivas e que podem fermentar lactose em 24 h a 44,5 C, com produção de gás. Este grupo é constituído quase exclusivamente pela espécie Escherichia coli, espécie indicativa de poluição fecal e portanto da possível presença de espécies entéricas patogénicas. "Streptococus" fecais - Este grupo inclui os estreptococos que indicam a qualidade sanitária da água e incluem as seguintes espécies: S. faecalis, S. faecium, S. bovis, S. equinus e S. avium. Material Amostra de água Tubos de LTB (Lauril Triptose Broth) (2X) com tubos invertidos Tubos de LTB (1X) com tubos invertidos Tubos de AD (Azida Dextrose) (2X) com tubos invertidos Tubos de AD (1X) com tubos invertidos Tubos de BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) com tubos invertidos Tubos de EC (Escherichia coli) com tubos invertidos Caixas de BEA (Biles Esculina Agar) Anças de inoculação Incubadora a 37 C Banho a 44,5 C Culturas de controlo Tubos de diluição com tampão 2

3 Método Teste Presuntivo - Para este teste, organizar 5 séries de 5 tubos de meio de cultura selectivo (LTB e AD). A primeira série deve ser de meio concentrado 2X. - Agitar a amostra vigorosamente. - Fazer diluições decimais seriadas da amostra: retirar 1ml de amostra e colocar em 9ml de tampão; agitar; retirar 1ml da diluição anterior e colocar em 9ml de tampão agitar. Repetir até atingir a diluição desejada que neste caso é de Inocular cada série de 5 tubos com diluições decimais decrescentes, da amostra: inocular na 1ª série 10ml de amostra; inocular na 2ª série 1ml de amostra; inocular na 3ª série 0.1ml de amostra; inocular na 4ª série 0.01ml de amostra; inocular na 5ª série 0.001ml de amostra; - Incubar os tubos 24 horas a 37 C. - Ler os resultados. São positivos os tubos de LTB que contiverem gás. São positivos os tubos de AD que tiverem crescimento. Os tubos positivos devem ser imediatamente confirmados no Teste Confirmativo. Os tubos negativos são reincubados mais 24 horas. - Ler os resultados após o 2º período de incubação. Se houver novos tubos positivos eles são também confirmados no Teste Confirmativo. 3

4 Teste Confirmativo Confirmação de coliformes totais -Inocular cada tubo positivo de LTB em meio de BGLB. -Incubar os tubos de BGLB a 37 C por um período de 24horas. -Ler os resultados. São positivos os tubos que contiverem gás. Os tubos negativos após este primeiro período de incubação são reincubados mais 24 horas. -Tomar nota do total de tubos positivos após os dois períodos de incubação. Confirmação de coliformes fecais - Inocular cada um dos tubos positivos de LTB em meio de EC. - Incubar os tubos de EC 24 horas a 44.5 C. - Ler os resultados. São positivos os tubos que contiverem gás. - Tomar nota do total de tubos positivos. Confirmação de Streptococcus fecais -Inocular caixas de Petri com meio de BEA a partir de cada um dos tubos positivos. -Incubar 24 horas a 37 C. -Ler os resultados. São positivos sempre que houver produção de pigmento negro. Reincubar as caixas negativas por mais 24horas. -No final dos dois períodos de incubação, tomar nota do total de caixas positivas. 4

5 Cálculo do valor do NMP -O cálculo da densidade de bactérias do grupo testado é baseado no número de tubos positivos de cada diluição, no Teste Confirmativo ( ou Completo). O resultado é dado com limite de 95% de confidência. -São necessárias 3 diluições para formular o código que permite a leitura na tabela do NMP. -O número de código tem 3 dígitos, sendo cada um, o número total de tubos positivos em cada diluição e por ordem decrescente de volume de inóculo. -Quando as séries de diluições decimais são diferentes de 10, 1 e 0.1ml de amostra (diluições para as quais a tabela está elaborada), o valor do NMP é calculado pela fórmula: NMP= NMP da tabela X 10 maior quantidade testada -Se foram testados mais de três volumes de amostra, determinam-se as três diluições mais significativas de acordo com as regras do NPM. 5