UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. Disciplina de Microbiologia

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1 UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Disciplina de Microbiologia AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIA 2017

2 LEMBRETES IMPORTANTES 1. Durante a permanência no laboratório de aulas práticas, é necessário o uso de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em uma sacola ou saco plástico, de modo a evitar possível contaminação do ambiente fora do laboratório. 2. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são realizados. 3. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas sobre a bancada ou chão, ferimentos de qualquer espécie, aspirações de culturas na boca, etc.). 4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado. 5. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório. 6. Não é permitido o uso de chinelo, sandália ou qualquer outro calçado que deixe os pés expostos. 7. Não serão permitidas fotografias no interior do laboratório, salvo em caso de autorização do docente responsável pela aula. RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS Após o término de cada aula prática, o aluno deverá entregar relatório individual da(s) atividade(s) do dia ao docente responsável pela mesma. No caso da atividade ocupar o tempo de mais de uma aula, o relatório correspondente deverá ser entregue ao final da última aula, sendo que o aluno que faltar em pelo menos uma das aulas necessárias para sua conclusão, terá nota igual a zero em seu relatório, mesmo que o entregue. Os relatórios deverão ser simples e objetivos. Devem ser apresentados de forma resumida, contendo o (s) objetivo (s), os procedimentos e os resultados dos experimentos. Devem ser manuscritos e preferencialmente não ocuparem mais que duas folhas.

3 MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA Nesta aula, será feita a observação de bactérias ao microscópio. Uma das lâminas será corada pelos alunos, conforme roteiro abaixo. As demais já foram coradas e estão prontas para a observação. Na observação das lâminas coradas pelo método de Gram, as bactérias deverão ser classificadas quanto à coloração (como Gram positiva ou negativa), o arranjo (agrupamento) e a morfologia (coco ou bacilo). Além das lâminas coradas pelo método de Gram, será feita a observação de uma lâmina contendo um esfregaço de escarro apresentando bacilos álcool-ácido resistentes (que não se coram pelo método de Gram) e corada pelo método de Ziehl-Neelsen. Coloração de Bactérias pelo Método de Gram - Lâminas contendo o esfregaço de bactérias - Bateria de Gram: violeta genciana (ou cristal violeta), lugol, álcool 95%, fucsina. Procedimento: a) Cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1 minuto. b) Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol. Esperar 1 minuto. c) Escorrer o lugol e descorar os esfregaços pelo álcool. Para isto, deixe o álcool cair, gota a gota, sobre a lâmina, mantendo-a inclinada. Considerar os esfregaços suficientemente descorados quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos. d) Lavar a lâmina em água corrente. e) Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30 segundos a 1 minuto. f) Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de filtro. g) Observar ao microscópio e desenhar na folha seguinte.

4 Desenhos: Lâmina A (Escherichia coli) Forma: Arranjo: Gram: Lâmina B (Staphylococcus aureus) Forma: Arranjo: Gram: Lâmina C (Streptococcus agalactiae) Forma: Arranjo: Gram:

5 Lâmina D (Bacillus cereus) Forma: Arranjo: Gram: Lâmina E (Neisseria sp) Forma: Arranjo: Gram: Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR) (Mycobacterium tuberculosis) Lâmina contendo um esfregaço de escarro de um paciente com tuberculose, corada pelo método de Ziehl- Neelsen e apresentando BAAR

6 MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias - Cultura A (Escherichia coli) - Cultura B (Staphylococcus aureus) - Cultura C (Streptococcus agalactiae) - Caldo sintético - Caldo comum - Caldo glicosado (caldo comum acrescido de 1% de glicose) - Alça de níquel cromo Procedimento: 1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios. 2. Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte. 3. Verificar a presença de crescimento (turvação do meio). 4. Anotar os resultados. Cultura A B C Crescimento em Caldo sintético Caldo comum Caldo glicosado B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano - Meio de Tiogel - Caldo simples - Cultura A (Escherichia coli) - Cultura D (Pseudomonas aeruginosa) - Cultura F (Clostridium sp) - Agulha de níquel cromo

7 Procedimento: Com a agulha de níquel cromo, semear as culturas A e D em tubos de tiogel e incubar em estufa a 37 C. No dia seguinte, observar o crescimento das culturas A e D juntamente com a cultura F que foi previamente semeada quando do preparo da aula prática. Classificar cada cultura quando à dependência de oxigênio em aeróbia, anaeróbia ou facultativa, conforme o local de seu crescimento no tubo de tiogel (em cima, no fundo ou em toda a extensão do tubo) Cultura A D F Local do crescimento no tubo Superfície Toda extensão Base do Meio Classificação

8 CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS A) Efeito de agentes físicos sobre as bactérias Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada ou não. Material - Suspensão da cultura A (Escherichia coli, bactéria não esporulada) em solução salina - Suspensão da cultura E (Bacillus cereus, bactéria esporulada) em solução salina - Placas de Petri contendo ágar nutriente e divididas em quadrantes, identificados pelo tempo de cultivo bacteriano em minutos (0, 5, 10 e 15 ). - Banho-Maria a 60º C - Alça de Níquel cromo Procedimento 1. Inocule (com a alça de níquel cromo) amostras das suspensões bacterianas A e E nas respectivas placas, no quadrante correspondente ao tempo Coloque, em banho-maria a 60º C, os tubos com a suspensões e, aos 5', 10' e 15', inocule novamente amostras das suspensões para os quadrantes correspondentes nas placas. 3. Deixe as placa na estufa a 37ºC até o dia seguinte. 4. Observe a variação quantitativa de crescimento bacteriano nos quadrantes em função do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++, conforme a intensidade de crescimento). Cultura A E Tempo de aquecimento

9 B) Efeito de agentes químicos (antisséptico para enxague bucal) - 3 suabes estéreis - Antisséptico bucal de uso comercial - 1 placa de ágar-nutriente, dividida em três partes (identificadas por A, B e C) Procedimento: 1. Friccionar um suabe estéril na mucosa da bochecha e espalhar ( em ziguezague ) seu conteúdo no quadrante A da placa de ágar nutriente. 2. Bochechar, por 1 minuto, com parte do o antisséptico bucal fornecido. 3. Aguardar aproximadamente 3 minutos e repetir a coleta do material, com outro suabe, espalhando seu conteúdo no quadrante B. 4. Bochechar novamente com o antisséptico bucal por 1 minuto. 5. Aguardar 3 minutos e repetir a coleta com um novo suabe estéril espalhando seu conteúdo no quadrante C. 6. Deixe a placa na estufa a 37 C até o dia seguinte. 7. Fazer a leitura das placas, anotando com cruzes (de + a ++++), na tabela abaixo, a intensidade do crescimento microbiano, conforme o tempo de exposição ao antisséptico bucal. Tempo de exposição* A B C Crescimento Microbiano *Tempo de exposição ao antisséptico = A (antes do tratamento), B (depois do primeiro tratamento) e C (depois do segundo tratamento). C) Efeito de agentes químicos sobre bactérias (álcool iodado a 0,1%) - 1 tubo contendo aproximadamente 1 ml de álcool iodado a 0,1% - 1 placa de ágar-nutriente dividida em duas partes iguais, identificadas como antes e depois - 3 suabes estéreis

10 Procedimento 1. Umedeça um suabe em salina, contida em um tubo de ensaio. Após retirar o excesso de salina, pressionando a suabe contra a parede do tubo, esfregue-a vigorosamente no dorso de uma das mãos; 2. Passe o suabe em uma das partes da placa com ágar nutriente ( antes ); 3. Umedeça um segundo suabe em álcool iodado a 0,1% e esfregue no dorso da outra mão; 4. Aguarde 2 minutos para que o antisséptico aja sobre a microbiota da pele; 5. Passe então, nessa área, um terceiro suabe umedecido em salina, tomando cuidado para não ultrapassar a área higienizada. Passe o suabe na superfície da outra metade da placa com ágar nutriente ( depois ) 6. Incube a placa na estufa a 37 C, durante uma noite. 7. Observe as placas e anote a intensidade do crescimento microbiano com sinal + (de + a++++) na tabela abaixo Sem álcool-iodado 0,1% Com álcool-iodado 0,1%

11 CONJUGAÇÃO BACTERIANA - 1 placa de ágar MacConkey contendo ácido nalidíxico (Nal), dividida em duas partes iguais, identificadas com as culturas a serem semeadas. - 1 placa de ágar MacConkey contendo cloranfenicol (Clo), dividida em duas partes iguais, identificadas com as culturas a serem semeadas. - 1 placa de ágar MacConkey contendo ácido nalidíxico e cloranfenicol (Nal + Clo) dividida em três partes, identificadas com as culturas a serem semeadas. - Escherichia coli C600, não fermentadora de lactose (lac-) (cultura A) em meio líquido. - Escherichia coli J53 fermentadora de lactose (lac+) (cultura B) em meio líquido - mistura das culturas A e B (cultura M) em meio líquido. - alça de níquel cromo. Procedimento: 1. Semear as culturas A e B nas partes correspondentes da placa de ágar MacConkey contendo Nal. Fazer o mesmo na placa contendo Clo. 2. Semear as culturas A, B e M nas partes correspondentes da placa de ágar MacConkey contendo Nal+Clo 3. Incube as placas a 37ºC até o dia seguinte. 4. Verificar a ocorrência de crescimento (+ ou -) e o fenótipo de fermentação de lactose (+ ou -) das culturas que cresceram e anote os resultados na tabela abaixo. Cultura Crescimento em ágar MacConkey contendo: Nal Clo Nal + Clo Fermentação da lactose A B M