Determinação de sensibilidade bacteriana aos antimicrobianos

Transcrição

1 Determinação de sensibilidade bacteriana aos antimicrobianos Prof. Adj. Ary Fernandes Junior Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências UNESP Tel /0413 ary@ibb.unesp.br

2 Diagnóstico microbiológico O diagnóstico laboratorial das doenças infecciosas começa com a indicação clínica adequada do exame microbiológico, o que requer conhecimento da epidemiologia e da fisiopatologia do processo infeccioso. requer o conhecimento e a colaboração de vários profissionais

3 A suspeita clínica do processo infeccioso determinará o tipo de amostra clínica que deve ser enviada ao laboratório para confirmar, estabelecer ou complementar o diagnóstico clínico A coleta e o transporte da amostra são etapas críticas na execução do exame microbiológico.

4 Representação esquemática do fluxograma da amostra clínica enviada para o exame microbiológico

5 Identificação laboratorial de patógenos clínicos (Fase analítica) Antibiograma

6 Antibiograma (Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI), Auxiliar o clínico com a escolha do antimicrobiano a prescrever para o paciente pois verifica se a bactéria pesquisada é sensível ou resistente aos antimicrobianos testados. Princípio da Diluição Princípio da Difusão

7 1.Métodos baseados na diluição da droga Diluição em caldo Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) Diluição em meio de cultura sólido diluição em agar CIM

8 Macrodiluição em tubos (1 a 2 ml de meio) Primeira a ser utilizada na avaliação da sensibilidade aos agentes antimicrobianos e envolve a preparação de diluições seriadas e logarítmicas de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4 e 8 μg/ml) em um meio de cultura líquido, o qual permitirá o crescimento bacteriano.

9 Determinação da CIM pelo método da diluição em caldo. A CIM no exemplo abaixo é de 16µg/ml.

10 Microdiluição em Placas de Elisa (100 a 200µ l)

11 Apresentação de uma placa utilizada no teste de microdiluição, após sua inoculação e incubação µg/ml Controles positivos

12 2.Métodos baseados na difusão da droga Princípio do método de Kirby - Bauer Parâmetros a serem padronizados: meio de cultura, discos, inoculação do germe no meio, incubação das placas, leitura e interpretação a.controle de qualidade

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14 Método de Kirby-Bauer Meio de Cultura (Mueller-Hinton Meio Padrão) Permite crescimento satisfatório da maioria dos germes não fastidiosos; Não interfere com a atividade da droga (Ex.: peptonas sulfas; Mg ++ - gentamicina; Ca ++, Fe ++, Mg ++ - tetraciclinas) São utilizadas placas de Petri (vidro ou plástico) com camada do meio de 6 mm de espessura

15 Inóculo (Padronizado) Preparo: Transferir para um tubo com BHI (Brain Heart Infusion) 5 colônias da bactéria em estudo; incubar a 37 o C; obter densidade equivalente ao padrão de Mc Farland 0,5 (1,5 x 10 8 UFC/mL) Obs. O padrão 0,5 de Mc Farland é o correspondente a turvação mostrada em solução contendo 0,5 ml de BaCl 2 a 1% em 99,5 ml de solução de ácido sulfúrico a 1%)

16 0,5 1,0 2,0 3,0 Tubos da escala de McFarland posicionados em frente do cartão de Wickerham. Comparação da escala 0,5 de McFarland com suspensão bacteriana (E. coli ATCC 25922)

17 Semeadura: Swab estéril; retirar excesso de caldo e semear na superfície do meio uniformemente; secar em temperatura ambiente por 3 a 5 minutos. Importante: número de colônias utilizadas (várias); material contaminado com flora normal (não usar colônias provenientes de meios de enriquecimento); variações na densidade do inóculo possibilitam variações também no tamanho do halo de inibição

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19 Discos Aplicação: pressionar levemente contra a superfície do meio e pelo menos 2 cm da borda da placa e a pelo menos 3 cm um do outro (evitar halos de inibição em fusão); usar apenas um disco de cada grupo de drogas (concentração única) Características: papel de filtro adequado; concentração de droga suficiente; prazo de validade; controle de eficiência

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24 Incubação das Placas Em temperatura (37 o C) e atmosfera adequada para o crescimento da bactéria (aerobiose, anaerobiose, 10% de CO 2 ) Atmosfera influi na atividade das drogas: tetraciclina, meticilina e novobiocina CO 2 ; estreptomicina e canamicina - anaerobiose

25 Leitura das Placas Após horas de incubação; usar compasso ou régua para determinar o diâmetro do halo de inibição; colônias dentro do halo sugerem mutantes resistentes ou contaminantes.

26 Halo de leitura em mm

27 Interpretação resistente, moderadamente resistente ou sensível, de acordo com o halo de inibição; há correlação inversa entre concentração inibitória mínima e diâmetro do halo de inibição.

28 Kirby e Bauer Método dos discos CIM (µg/ml) Resistente Intermediário Sensível Halo de inibição (mm)

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31 Etest ( teste da elipse = Episilometer test)

32 Área de Crescimento bacteriano Fita graduada de material impermeável Elipse de inibição Concentração Inibitória Mínima (CIM) Apresentação do Etest para avaliação da CIM após incubação