Procedimentos Técnicos. NOME FUNÇÃO ASSINATURA DATA Dr. Renato de Lacerda Barra Filho Dr. Ivo Fernandes. Gerente da Qualidade Biomédico

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1 Versão: 01 Pg: 1/5 ELABORADO POR DE ACORDO NOME FUNÇÃO ASSINATURA DATA Dr. Renato de Lacerda Barra Filho Dr. Ivo Fernandes Biomédico 01/10/2009 Gerente da Qualidade Biomédico 20/10/2009 Dr. Jose Carlos APROVADO POR Diretor Executivo 30/10/2009 dos Santos HISTÓRICO DAS REVISÕES Versão Revisado por Data Assinatura Aprovado por Data Assinatura REVALIDAÇÃO ANUAL Versão Responsável Data Versão Responsável Data 1 Ivo 01/10/ NOME/ SINONÍMIAS/ MNE PREPARO DE MEIO DE CULTURA 2. PRINCÍPIO DO TESTE Os meios de cultura destinam-se ao cultivo de microrganismos. Além dos principais nutrientes necessários, eles devem oferecer também todas outras condições indispensáveis ao crescimento dos microrganismos, como: pressão osmótica, ph, fonte de hidrogênio e carbono, vitaminas, sais minerais essenciais e água. De acordo com as exigências nutritivas dos microrganismos, temos uma grande variedade de meios de cultura, desde os mais simples, constituído unicamente por sais minerais dissolvidos na água, até os mais complexos. Os meios de acordo com o seu estado físico podem ser sólidos, semi-sólido e líquidos O uso de meio de cultura sólido empregando o Agar que é uma gelose, preparada a partir de certas espécies de algas marinhas, é de grande utilidade para o isolamento dos microrganismos. Usando-se os meios líquidos este trabalho de isolamento torna-se quase impossível. Nos meios sólidos obtém-se esta separação com relativa facilidade, desde que as técnicas de semeadura sejam corretas, pois as bactérias geralmente crescem sob a forma de colônias perfeitamente isoladas. Os meios podem ser: Meios simples: são destinados ao cultivo de microorganismos pouco exigentes ou serve de base para outros meios. Exemplo: Caldo simples, água peptonada. Meios seletivos: São meios que selecionam as bactérias, geralmente inibindo o crescimento de algumas e favorecendo o crescimento de outras. Tal poder seletivo se obtém pela função de certas substâncias, como por exemplo: corantes (cristal de violeta, eosina, azul de metileno), altas concentrações de cloreto de sódio e os sais biliares. Meios diferenciais: São meios que permitem o crescimento de várias espécies ao mesmo tempo em que proporcionam um ambiente que facilita a discriminação entre os diferentes microrganismos. Exemplo: o Agar Sangue pode ser usado para diferenciar numerosas espécies bacterianas, principalmente as que pertencem ao gênero Streptococcus, elas produzem enzimas e compostos correlatos diferentes, que reagem de maneiras diversas. A diferenciação pode ser obtida pela adição do sangue de carneiro, com base nestes efeitos temos três tipos de hemólise: - Alfa-hemolise: área de coloração esverdeada ao redor das colônias bacterianas. Ocorre lise parcial das hemácias. - Beta hemólise: áreas claras que cercam as colônias bacterianas. Ocorre lise total das hemácias. - Gama hemólise: não ocorre lise das hemácias

2 Versão: 01 Pg: 2/5 3. SIGNIFICADO CLÍNICO 4. COLETA E TRATAMENTO DA AMOSTRA 4.1 Coleta da amostra: 4.2 Tipos de Amostra: 4.3 Volume mínimo para análise: 4.4 Rejeição de amostras: 4.5 Condições de acondicionamento: 4.6 Tratamento e pré-tratamento da amostra: 5. MATERIAL REQUERIDO 5.1 Proveta 5.2 Balança 5.3 Bico de bunsen 5.4 Balão de fundo chato 5.5 Autoclave 5.6 Estufa 5.7 Papel alumínio 5.8 Placa de petri estéril 5.9 Espátula 5.10 Luvas 5.11 Óculos de proteção 6. REAGENTES 6.1 Meio de cultura. 6.2 Água destilada tipo I. 7. PROCEDIMENTO DETALHADO PREPARO DOS MEIOS Agar Chocolate Pronto para uso. Agar MacConkey Pronto para uso. Ágar Mueller Hinton Pronto para uso Ágar Sangue

3 Versão: 01 Pg: 3/5 Pronto para uso SS (Salmonella Shiguella) Aquecer até ferver, evitando superaquecer o meio. Não autoclavar. Resfriar até 50º C e distribuir 20 a 25 ml em placas de petri estéreis. Deixar a temperatura ambiente até esfriar. BHI Distribuir 2-4 ml em tubo estéril Fechar o tubo com gaze Autoclavar a 121ºC por 15 minutos Retirar da autoclave e esfriar a temperatura ambiente Cled Pronto para uso Citrato Distribuir 2-4 ml em tubo estéril Fechar o tubo com gaze Autoclavar a 121ºC por 15 minutos Retirar da autoclave e esfriar a temperatura ambiente ARMAZENAMENTO E CONSERVAÇÃO Tanto as preparadas quanto as prontas para uso devem ser conservadas em temperatura de 2º a 8º C. VALIDADE Os meios sólidos têm validade de 3 meses contando da data de preparo. FINALIDADE A finalidade de cada meio se encontra na tabela abaixo: MEIO DE CULTURA Agar Chocolate MacConkey FINALIDADE Isolamento de Haemophilus spp e Neisseria spp em amostras clinicas Isolamento de bacilos Gram negativos e verificar a fermentação ou não da

4 Versão: 01 Pg: 4/5 lactose. Inibe o crescimento de cocos Gram positivos. Microrganismos lactose positiva aparecem na cor rosa e microrganismos lactose negativa aparecem incolores ou transparentes. Mueller Hinton Utilizado para realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelo método de difusão em disco (Kirby-Bauer) para bactérias de crescimento rápido. Agar Sangue Utilizado para realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelo método de difusão em disco (Kirby-Bauer) de cepas de Streptococcus sp Isolamento da maioria dos microrganismos. O valor do ph de 6,8 é especialmente favorável para conservação dos eritrócitos, formação e visualização de hemólise. SS Meio para isolamento de Salmonella e Shiguella sp. Permite diferenciar bactérias lactose positivas e negativas, além de detectar a produção de H2S BHI Meio adequado para o cultivo primário de muitas bactérias exigentes ou não, como estreptococcus, pneumococcus, meningococcus, enterobactérias, etc. Cled Usado para isolamento, identificação de microrganismos presentes em amostra de urina. A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus. 8. CÁLCULOS/ LIBERAÇÃO DOS RESULTADOS 9. CONTROLE DE QUALIDADE Consultar Plano de Qualidade. 10. INTERVALO DE REFERÊNCIA 11. INTERVALO CRÍTICO 12. CONFIABILIDADE ANALÍTICA 13. INTERFERENTES Erro no momento de pesar os ingredientes Balança não calibrada Má conservação dos meios Solubilização incompleta do ágar Homogeneização inadequada Distribuição incorreta dos meios. Ex: Mueller Hinton deve ter de 3 a 4 mm de espessura, se não ocorre erro de difusão dos discos de antibióticos. A difusão poderá ser em profundidade e o halo menor, se o meio ocupar mais de 1/3 da placa, ou longitudinalmente e o halo maior, se ocupar menos que 1/3 da placa. A água para hidratar os meios deve ser destilada ou deionizada e nunca utilizar água de torneira e o volume deve ser rigorosamente respeitado;

5 Versão: 01 Pg: 5/5 Seleção prévia da vidraria de acordo com o sistema de distribuição. Condições de esterilização para cada meio devem ser cuidadosamente observadas. Em geral, o processo é realizado a 121ºC por 15 minutos. Armazenamento das placas e tubos em embalagens plásticas antes do completo resfriamento Armazenamento em temperatura inadequada. Nunca estocar meios de cultura em refrigeradores frostfree. 14. INTERVENÇÕES Desconsiderar contaminações esporádicas (1 unidade). Descartar o lote inteiro se ocorrer contaminação significativa ( 10% da amostragem) 15. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS - Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds): Manual of Clinical Microbiology, 7ª ed. American Society for Microbiology, Washington, DC, Silva CPHM: Bacteriologia, um texto ilustrado, 1ª ed. Rio de Janeiro, Ed. Eventus, Koneman, EW: Diagnóstico Microbiológico- Texto e Atlas Colorido, 5ª ed, MEDSI, Oplustil, CP: Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica, Ed. Saraiva, São Paulo, www. Saúdetotal.com.Br - Pilonetto, Marcelo e Daniela Pilonetto. Manual de Procedimentos Laboratoriais em Microbiologia. - POP s em Microbiologia. Pinhais, ed Microscience, 1998