Resistência bacteriana as drogas antimicrobianas

Transcrição

1 Resistência bacteriana as drogas antimicrobianas

2 Variação permanente resultante de Mutação tempo 1. População de uma bactéria em processo de multiplicação minutos, horas, dias, meses 5. Os mutantes continuam com o crescimento na presença do antimicrobiano e iniciam dispersão pelo ambiente 2. Processo de crescimento e divisão produzem naturalmente células mutantes Pressão seletiva 4. Células são mortas ou impedidas de multiplicação pela antimicrobiano com exceção dos mutantes resistentes ao antimicrobiano específico. Células são expostas a um composto antimicrobiano 3. População continua multiplicação, e originando ocasionalmente, mais células mutantes

3 Variação permanente resultante de Recombinação Genética 1. Duas populações bacterianas A e B crescem em um mesmo ambiente. A espécie B é resistente a droga X. 2. Troca de DNA (elementos genéticos móveis) ocorre entre células em baixa frequência. Pressão seletiva 4. Na presença da droga X, as células da espécie A que receberam gen da resistência da espécie B são capazes de multiplicar-se enquanto que as células originalmente sensíveis não multiplicam-se. Bactérias são expostas a droga X. 3. Células da espécie A recebem o gen de resistência a droga X, presente no elemento genético móvel da espécie B.

4 Sítios de ação de drogas antibacterianas Azitromicina Claritromicina Estreptograminas (Quinopristina/ Dalfopristina) Tigeciclina Síntese de lipídeos Platensimicina Streptomyces platensis

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7 DEFINIÇÕES Resistente: É aquela capaz de crescer in vitro em presença da concentração média que a droga atinge no sangue do hospedeiro durante o tratamento, quando administrada por via oral Sensível: Quando não cresce nestas condições

8 TIPOS DE RESISTÊNCIA Natural: Todos os indivíduos da espécie são resistentes Ex. Ausência do sítio de ação (Drogas que atuam na parede; Macrolídeos e ausência de receptores nos ribossomos de Gram negativas)

9 Adquirida: Linhagens resistentes e sensíveis na mesma espécie Mecanismos genéticos - Mutações e Recombinação Genética Resistência é vantajosa só na presença da droga (não provoca inibição ou morte de possíveis competidores da bactéria resistente)

10 Natural ou intrínseca: Bactéria está fora do espectro de ação da droga Resistência EXEMPLOS: Penicilina G Bactérias Gram negativas Penicilinas Micoplasma Vancomicina Bactérias Gram negativas Aminoglicosídeos Bactérias anaeróbias Adquirida: Por mecanismos genéticos diversos, surgem numa população bacteriana amostras que não sofrem mais a ação da droga, que é eficaz contra o resto da população

11 Resistência Cromossômica (Mutação) Resistência Simples (uma única droga) É possível a transferência desta resistência

12 Tipos de Resistência Cromossômica

13 Resistência Extra-Cromossômica Plasmídeos Plasmídeo R (possuir o segmento FTR Plamídeo F) Perda do fator de resistência ( Cura ) (Repiques frequentes, uso de substâncias químicas)

14 Expressão Bioquímica da Resistência

15 Drogas que inibem a RNA Polimerase: Rifampicina Mecanismos de ação Drogas que inibem a síntese do DNA: Fluoroquinolonas. Mecanismos de resistência Redução na permeabilidade para a droga. Bomba de Efluxo Parede bacteriana Drogas que inibem a formação da parede bacteriana: Penicilinas, Cefalosporinas, Manobactâmicos, Carbapenem, Vancomicina, Drogas que agem sobre os ribossomos e síntese protéica: Aminoglicosídeos, Tetraciclinas, Macrolídeos, Clindamicina, Cloranfenicol, Linezolida. Drogas que agem sobre a membrana plasmatica alterando sua estrutura :Polimixinas, Daptomicina. Alteração ou destruição da droga por enzimas (ex. β-lactamase, fosfotransferases, adenilase, acetilase, acetiltransferase) Modificação no sítio de ação da droga. (PBP, DNA girase, ribossomos)

16 -lactamases do Grupo 1 (AmpC( AmpC) Testes de sensibilidade aos antimicrobianos Kirby&Bauer E Teste

17 Determinação de sensibilidade bacteriana aos antimicrobianos Prof. Ary Fernandes Junior Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências - UNESP Distrito de Rubião Júnior s/n CEP / Botucatu/ SP /Brasil Tel /0413 ary@ibb.unesp.br

18 Diagnóstico microbiológico O diagnóstico laboratorial das doenças infecciosas começa com a indicação clínica adequada do exame microbiológico, o que requer conhecimento da epidemiologia e da fisiopatologia do processo infeccioso. requer o conhecimento e a colaboração de vários profissionais

19 A suspeita clínica do processo infeccioso determinará o tipo de amostra clínica que deve ser enviada ao laboratório para confirmar, estabelecer ou complementar o diagnóstico clínico A coleta e o transporte da amostra são etapas críticas na execução do exame microbiológico.

20 Representação esquemática do fluxograma da amostra clínica enviada para o exame microbiológico

21 Identificação laboratorial de patógenos clínicos (Fase analítica) Antibiograma

22 Antibiograma (Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI), Auxiliar o clínico com a escolha do antimicrobiano a prescrever para o paciente pois verifica se a bactéria pesquisada é sensível ou resistente aos antimicrobianos testados. Princípio da Diluição Princípio da Difusão

23 1.Métodos baseados na diluição da droga Diluição em caldo Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) Diluição em meio de cultura sólido CIM

24 Macrodiluição em tubos (1 a 2 ml de meio) Primeira a ser utilizada na avaliação da sensibilidade aos agentes antimicrobianos e envolve a preparação de diluições seriadas e logarítmicas de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4 e 8 μg/ml) em um meio de cultura líquido, o qual permitirá o crescimento bacteriano.

25 Determinação da CIM pelo método da diluição em caldo. A CIM no exemplo abaixo é de 16µg/ml.

26 Microdiluição em Placas de Elisa (100 a 200µ l)

27 Apresentação de uma placa utilizada no teste de microdiluição, após sua inoculação e incubação µg/ml Controles positivos

28 2.Métodos baseados na difusão da droga Princípio do método de Kirby - Bauer Parâmetros a serem padronizados: meio de cultura, discos, inoculação do germe no meio, incubação das placas, leitura e interpretação a.controle de qualidade

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30 Método de Kirby-Bauer Meio de Cultura (Mueller-Hinton Meio Padrão) Permite crescimento satisfatório da maioria dos germes não fastidiosos; Não interfere com a atividade da droga (Ex.: peptonas sulfas; Mg ++ - gentamicina; Ca ++, Fe ++, Mg ++ - tetraciclinas) São utilizadas placas de Petri (vidro ou plástico) com camada do meio de 6 mm de espessura

31 Inóculo (Padronizado) Preparo: Transferir para um tubo com BHI (Brain Heart Infusion) 5 colônias da bactéria em estudo; incubar a 37 o C; obter densidade equivalente ao padrão de Mc Farland 0,5 (1,5 x 10 8 UFC/mL) Obs. O padrão 0,5 de Mc Farland é o correspondente a turvação mostrada em solução contendo 0,5 ml de BaCl 2 a 1% em 99,5 ml de solução de ácido sulfúrico a 1%)

32 0,5 1,0 2,0 3,0 Tubos da escala de McFarland posicionados em frente do cartão de Wickerham. Comparação da escala 0,5 de McFarland com suspensão bacteriana (E. coli ATCC 25922)

33 Semeadura: Swab estéril; retirar excesso de caldo e semear na superfície do meio uniformemente; secar em temperatura ambiente por 3 a 5 minutos. Importante: número de colônias utilizadas (várias); material contaminado com flora normal (não usar colônias provenientes de meios de enriquecimento); variações na densidade do inóculo possibilitam variações também no tamanho do halo de inibição

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35 Discos Aplicação: pressionar levemente contra a superfície do meio e pelo menos 2 cm da borda da placa e a pelo menos 3 cm um do outro (evitar halos de inibição em fusão); usar apenas um disco de cada grupo de drogas (concentração única) Características: papel de filtro adequado; concentração de droga suficiente; prazo de validade; controle de eficiência

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40 Incubação das Placas Em temperatura (37 o C) e atmosfera adequada para o crescimento da bactéria (aerobiose, anaerobiose, 10% de CO 2 ) Atmosfera influi na atividade das drogas: tetraciclina, meticilina e novobiocina CO 2 ; estreptomicina e canamicina - anaerobiose

41 Leitura das Placas Após horas de incubação; usar compasso ou régua para determinar o diâmetro do halo de inibição; colônias dentro do halo sugerem mutantes resistentes ou contaminantes.

42 Halo de leitura em mm

43 Interpretação resistente, moderadamente resistente ou sensível, de acordo com o halo de inibição; há correlação inversa entre concentração inibitória mínima e diâmetro do halo de inibição.

44 Curva de regressão linear da correlação entre a CIM e o halo de inibição.

45 Kirby e Bauer Método dos discos CIM (µg/ml) Resistente Intermediário Sensível Halo de inibição (mm)

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48 Etest ( teste da elipse = Episilometer test)

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50 Área de Crescimento bacteriano Fita graduada de material impermeável Elipse de inibição Concentração Inibitória Mínima (CIM) Apresentação do Etest para avaliação da CIM após incubação

51 Muito obrigado!!!!