Cultivo de microrganismos. Cultivo em meio líquido. Cultivo em meio sólido 27/11/2013 CULTIVO DE MICRORGANISMOS EM LABORATÓRIO

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1 Cultivo de microrganismos Disciplina: Microbiologia Geral 1) Inoculação CULTIVO DE MICRORGANISMOS EM LABORATÓRIO 2) Isolamento 3) Preservação Inoculação Semear ou inocular: introduzir artificialmente uma quantidade de amostra (inóculo) em um meio de cultura adequado, com a finalidade de iniciar um cultivo microbiano. Incubação: Após a inoculação, o meio de cultura é mantido a uma temperatura adequada para o crescimento. A inoculação pode ser realizada em meio líquido, sólido ou semi-sólido, utilizando-se uma alça ou pipeta estéril. Cultivo em meio líquido Fig. 1 Tubo à direita, meio BHI sem semeadura; tubo à esquerda, meio BHI após crescimento bacteriano. Observar turvação indicativa de multiplicação microbiana. Cultivo em meio sólido Pode ser conduzido em tubos ou placas Isolamento Consiste na obtenção da sua cultura pura; É essencial para se ter o microrganismo disponível para estudos de morfologia, taxonomia, reprodução e fisiologia. (A) Fig. Distribuição de meio de cultura pelas placas de Petri (A) e Inoculação dos meios de cultura sólidos (B). (B) As operações de isolamento são executadas sob rigorosa assepsia, em ambiente próprio, usando-se ferramentas e material desinfestados ou esterilizados. 1

2 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS IMPORTÂNCIA Diversidade de microrganismos Encontrados em culturas mistas com muitas espécies diferentes ocupando o mesmo ambiente Estudo das propriedades de um determinado microrganismo em particular é necessário isolá-lo em cultura pura, isenta dos demais organismos. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS -Importante: conhecimento prévio da ecologia e necessidades nutricionais do microrganismo -Condições de cultivo: Luz, Temperatura, Umidade, Oxigênio Contaminantes presentes no ar correspondem ao principal problema, pois o ar sempre contém partículas de poeira, que em geral apresentam uma grande comunidade de microrganismos Quando recipientes são abertos, estes devem ser manipulados de maneira a impedir a entrada de ar contaminado -Condições do material a ser analisado: órgãos de plantas, solo, sementes Procedimentos: a.) Flambar a alça; b.) remover o tampão de algodão; c.) introduzir a alça na cultura de bactéria; Procedimentos: d.) Mergulha a alça na cultura de bactéria; e.) Flamba a boca do tubo; f.) Introduzir a alça no tubo contendo meio de cultura; 2

3 Condições de incubação - Sucesso do isolamento depende das condições de incubação (temperatura, luminosidade e umidade); - Temperatura: entre 20-25ºC favorece a maioria dos fungos fitopatogênicos; TºC ótima varia com a espécie envolvida; - A luminosidade pode estimular ou inibir o desenvolvimento do microrganismo, principalmente a produção de esporos (importante na identificação das espécies); MÉTODOS DE ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS -Câmara úmida para indução da esporulação; -Isolamento de microrganismos do ar; -Isolamento de microrganismos do solo; -Isolamento direto; -Isolamento monospórico; -Isolamento de tecidos e órgãos de plantas infectadas; - Microrganismos que ocorrem em condições de alta umidade, requerem, no período de incubação, um ambiente adequado para concretização do processo; Isolamento de microrganismos do ar (anemófilos) Isolamento de microrganismos do solo -Método da sedimentação em placas de Petri contendo meio de cultura; -As placas são abertas e expostas no ambiente por 30 minutos -Análise do ambiente interno e externo Isolamento de tecidos e órgãos de plantas infectadas Isolamento de fungos fitopatogênicos - Material deve apresentar boas condições e exibir sintomas típicos da doença; - Deve ser retirado da região de transição, entre o tecido doente e o sadio 3

4 Técnica da semeadura Técnica de semeadura em meio sólido A escolha da técnica de cultivo de microrganismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo Técnica de semeadura em meio líquido Técnica de semeadura em meio sólido inclinado Técnica de semeadura em meio sólido - utilizando placas de Petri - Esgotamento Tubos de ensaio com cultura de microrganismos Colônia bacteriana 4

5 Preservação Importância -Manutenção de uma coleção de microrganismos -Permite que a pesquisa científica possa ser realizada em qualquer época do ano -Armazenamento da cultura por longos períodos e utilização periódica -Garantia da sobrevivência, estabilidade e pureza Armazenamento de culturas por longos períodos e utilização periódica para pesquisa e/ou produção Evitar Contaminação Perda de viabilidade Mutação (perda das características fisiológicas) Método adequado para um microrganismo pode não ser adequado para outro; Meios usados para um grande número de fungos (BDA, malte-ágar, V8-ágar, aveia-ágar, Czapeck, cenoura ágar). Escolha do método de preservação Manutenção da viabilidade: perda de células no processo de preservação e durante o armazenamento Manutenção das propriedades originais: perda de características de interesse científico ou industrial Pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo Custos de preservação e manutenção Escolha do método de preservação Tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento; Importância do acervo: conseqüência de sua eventual perda; culturas com potencial biotecnológico preservação por mais de um método; Necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada para embalagem de envio e condições de transporte Disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros MÉTODOS DE PRESERVAÇÃO DE MICRORGANISMOS Curto prazo repique contínuo Médio prazo Preservação em óleo mineral Preservação em água Congelamento a -20 C Secagem em sílica, solo Longo prazo Liofilização Congelamento a -70 C Criopreservação em nitrogênio líquido Curto Prazo Repicagens Periódicas Consiste na repicagem de microrganismos, em tubos de ensaio contendo meios adequados (4 a 5 vezes ao ano), de modo que o microrganismo seja transferido para outro tubo antes que o substrato esteja completamente consumido. Fatores a serem considerados Meio adequado para manter a cultura Temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 2-3 meses; geladeira (4 a 7 ºC) de 4-6 meses Freqüência entre as transferências: determinação empírica minimizar o n de repiques evitar a seleção de mutantes examinar a pureza em cada transferência conservar em duplicata 5

6 Curto Prazo Repicagens Periódicas Curto Prazo Repicagens Periódicas Vantagens Baixo custo Não requer equipamentos especializados O manuseio é simples Desvantagens Riscos de contaminação e possível perda do material; Perda de características morfológicas, fisiológicas ou patogenicidade; Seleção de células atípicas (variantes ou mutantes); Supervisão especializada; Mão-de-obra; Espaço relativamente grande para o armazenamento; Médio Prazo Preservação em óleo mineral Consiste em recobrir culturas jovens, desenvolvidas pelo método clássico em tubos de ensaio, com uma camada de óleo mineral esterilizado; Previne-se a desidratação do meio de cultura, reduzindo a atividade metabólica dos organismos preservados; Redução do oxigênio disponível, uma vez que o óleo permite uma lenta difusão de gases; Redução da atividade metabólica é evidenciada pelo retardamento do crescimento e da esporulação; Médio Prazo Preservação em óleo mineral Óleo mineral deve ter pureza elevada; deve ser autoclavado por duas horas; Superfície inclinada da cultura precisa ser totalmente recoberta pelo óleo, pois o micélio em contato com o ar drena a água do meio para o exterior, levando à desidratação total da cultura; A temperatura do ambiente de armazenamento deve ser ajustada às necessidades individuais dos microrganismos a serem preservados; Repicagens provenientes de culturas em óleo devem ser feitas para o mesmo meio sobre o qual a espécie esta sendo preservada e isso deve ser feito após a drenagem total do óleo. Médio Prazo Preservação em óleo mineral Vantagens - custo de equipamento; - evita contaminação por ácaros; Desvantagens - necessidade de mais transferências até que a cultura revigore; - requer espaço para amazenamento; Armazenamento em geladeira ou em ambiente 6

7 Médio Prazo Preservação em água (Castellani) Geladeira Blocos de ágar de 4-6 mm ml água destilada esterilizada Médio Prazo Preservação em água (Castellani) Médio Prazo Preservação em solo ou areia Preservação em água armazenamento em geladeira Vantagens - boa taxa de viabilidade - evita contaminação por ácaros Desvantagens - dificuldade da retirada dos cubos na reativação (Castellani) - requer espaço p/ armazenamento - riscos de contaminação Foi idealizado e empregado por muito tempo para a conservação de bactérias; Teve também aceitação ampla em diversos laboratórios para conservação de fungos; Inoculação de um pequeno volume de solo seco e estéril ou areia estéril, com pequena quantidade de suspensão de esporos do fungo que se deseja manter, seguindo-se a imediata secagem; Não permite o crescimento do fungo e preserva os conídios ou esporos inicialmente introduzidos no solo; Médio Prazo Preservação em solo ou areia Vantagens Permitir longos períodos de preservação (ao redor de 5 ou mais anos); Modificações morfológicas ou fisiológicas são reduzidas ou praticamente eliminadas; Obtenção de inóculo por longos períodos, repicando-se pequenas porções de solo quando se necessita reativar a cultura; Manter a capacidade esporulação do fungo. Desvantagens Funciona apenas para um número reduzido de fungos (capacidade de produzir esporos, ex. escleródios, clamidósporos, microescleródios, etc) Dificuldade de se perceber contaminações (são notadas quando se repica o inóculo para obtenção de subculturas. Médio Prazo Preservação em sílica Recomendado para aqueles organismos que não toleram liofilização e Nitrogênio líquido. Organismos esporulados são estocados em sílica gel protegidos através do leite desnatado. Sílica gel fina sem corante esterilizada (90 min a 180 oc); Suspensão esporos/células em leite desnatado a 10% e a 40 C; Resfriar a sílica a 4 oc; Adicionar 0,5 ml em 4 g e acondicionar em vidros; Deixar os vidros a 4 oc por 30 min; Estocar por 1 a 2 semanas com as tampas frouxas; Testar a viabilidade; Vedar os vidros; 7

8 Longo Prazo Liofilização - Recomendado para preservação de vários microrganismos, por longo período (20 a 30 anos); A liofilização remove a água e outros solventes do produto congelado pelo processo de sublimação. A sublimação ocorre quando a água no estado sólido é convertida directamente em vapor de água, sem passar pelo estado líquido. - Processos: - precongelamento; - centrifugação-desidratação-congelamento e - desidratação a vácuo; - Tecnicamente mais complicado (habilidade e equipamento dispendioso). Longo Prazo Liofilização Longo Prazo Congelamento em Nitrogênio Líquido Vantagens vedação total da amostra longa viabilidade estabilidade elevada em muitas espécies produção em larga escala não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz) fácil distribuição e transporte Desvantagens muitas espécies não sobrevivem ao processo viabilidade ocasionalmente insatisfatória mão-de-obra especializada requer equipamentos sofisticado princípio indução da dormência do microrganismo armazenamento a C fatores a serem considerados tipo de microrganismo idade da cultura agente crioprotetor condições de estocagem método de descongelamento Longo Prazo Congelamento em Nitrogênio Líquido Longo Prazo Congelamento em Nitrogênio Líquido vantagens condições estáveis por longos períodos vedação completa, evitando contaminação utilização para esporulados e não esporulados desvantagens viabilidade ocasionalmente insatisfatória requer equipamento sofisticado suprimento contínuo de N 2 boa infra-estrutura caso de acidentes de vazamento 8

9 CONSIDERAÇÕES FINAIS O trabalho com microrganismos: -Identificação -Diagnose -Caracterização Conhecimento prévio de características Leitura, referências bibliográficas, busca por mais informações Adequação dos métodos com a estrutura do laboratório 9