Como cultivar os microrganismos??

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1 Aula 3 teórica: Meios de cultura Profa. Dra. Ilana Camargo Como cultivar os microrganismos?? 1

2 Onde isolar? Meios de cultura: Material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de microrganismos. Fazer a partir de pós desidratados; Comprar meios preparados (prontos para o uso) Onde colocar? Placas de Petri; Tubos de ensaio. Como escolher o meio para o isolamento? A) origem do material a ser analisado; B) A espécie que se imagina estar presente; C) Necessidades nutricionais dos organismos. Meios Líquidos, semi-sólidos e sólidos Agar foi descoberto no Japão (Kanten) a partir de algas marinhas e é utilizado em comidas. Holandeses passaram a usar agar em alimentos; Fannie Hess, esposa do pesquisador Walter Hess utilizava agar em geléias. Walter testou em meios de cultura e escreveu para Robert Koch Até cerca de 1880, as culturas eram todas líquidas. Koch havia tentado usar gelatina, mas esta derretia a 37 C. Ao ver a utilidade do agar, Robert Koch passou a utilizá-lo em meios de cultura para o cultivo de bacilos da tuberculose. AGAR Sem cor Sem gosto Sem odor Gelatinoso Bactérias não o degradam! 2

3 Diferentes concentrações de ágar diferentes estados físicos Sólidos contém agentes solidificantes, principalmente ágar (cerca de 1 a 2,0 %); Semi-sólidos a quantidade de ágar é de 0,075 a 0,5 %, dando uma consistência intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas; Líquidos sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros. H 2 O H 2 O H 2O H 2 O Autoclavar 121 C por 20 minutos Distribuir em placas estéreis 3

4 Meio autoclavado = Calor!! Materiais Tubos de ensaio Placas de Petri 4

5 5

6 Placas de Richard Petri Placas de Petri

7 Instrumentação e técnicas básicas de assepsia Sobre as aulas práticas Profa. Dra. Ilana Camargo Isolamento de microrganismos em Cultura Pura Inóculo: material a ser semeado, colocado no meio de cultura. Incubação: bactérias 37 C / 24horas; Fungos C Durante a incubação as células individuais se multiplicam e produzem um grande número de células = Colônia - visível a olho nu. Cada colônia é uma cultura pura com ancestral único. Colônia Todas as células em uma colônia têm o mesmo parentesco. 7

8 Ao semear... 1 célula (Unidade formadora de colônia UFC) 1 colônia 8

9 Isolamento de microrganismos em Cultura Pura Objetivo dos métodos: Diminuir a população microbiana, assim as células individuais estarão localizadas a uma certa distância umas das outras. Para isolar uma cultura pura, uma colônia individual é transferida do meio para outro em placa ou tubo. Diferenças morfológicas de colônias entre as diferentes espécies: - aderente; - rugosa; -elevada; - irregular; - lisa; - regular; - seca; Classificação e Identificação Características morfológicas Diferenças morfológicas de colônias (Macroscópica) 9

10 Isolamento de colônias para posteriormente obter cultura pura Objetivo dos métodos: Diminuir a população microbiana, assim as células individuais estarão localizadas a uma certa distância umas das outras. Para obter uma cultura pura, uma colônia individual é transferida do meio para outro em placa ou tubo. Cultura mista Cultura pura Cultura Pura Onde todas as células na população são idênticas e todas se originaram de uma mesma célula parenteral. Natureza - Culturas mistas: muitas espécies diferentes no mesmo ambiente Primeiro passo: Isolar as diferentes espécies contidas em um espécime (amostra). Cultura mista Cultura pura 10

11 Manobras assépticas Manobras assépticas 11

12 Manobras assépticas 12

13 Técnicas de transferência Técnicas de transferência Swab de algodão esterilizado 13

14 Métodos de isolamento de microrganismos Métodos de isolamento de microrganismos: - Espalhamento em placa; - Pour-plate; - Esgotamento por estrias; 14

15 Método Pour Plate Método Espalhamento em placa Espátula de Drigalski 15

16 Método de espalhamento em placa Método de esgotamento por estrias em placa Por estrias 16

17 Por estrias Método de esgotamento em placa Por estrias 17

18 18

19 Contagem de colônias Contagem de colônias Método Pour Plate 19

20 Contagem de colônias UFC = Unidade Formadora de Colônia Tubo 10-3 = 50 UFC No tubo original = 50 x 1 x x 10 4 UFC/mL Microrganismos em meio de cultura 40 20

21 Meios de Cultura Soluções nutrientes utilizadas para promover o crescimento de microrganismos em laboratório. Inóculo: microrganismos que são colocados em um meio de cultura para iniciar o crescimento. Cultura: microrganismos que crescem e se multiplicam nos meios de cultura. Meios Quimicamente definidos: Quantidades precisas de compostos químicos inorgânicos ou orgânicos altamente purificados, adicionados a água destilada. Complexos (ou indefinidos): Não se conhece a composição precisa de alguns componentes. Empregam produtos de digestão da caseína (proteína do leite), de carne, de soja, de leveduras, extratos de plantas, entre outros. 41 Microrganismos em meio de cultura complexo Composição: Peptona (Fonte de nitrogênio) Triptose (reações de fermentações) Extrato de carne (carboidratos, constituintes minerais, vitaminas) Extrato de leveduras (Fonte de vitaminas) Água (destilada / deionizada) Sangue (Fator de crescimento, rico em nitrogênio, carboidratos e vitaminas) 42 21

22 Ágar: polissacarídeo complexo solidificante obtido de algas marinhas. Poucos microrganismos degradam o ágar. Temperatura de fusão inferior à temperatura da água. Permanece líquido até 40ºC. Na técnica de Pour plate o ágar é mantido a 50ºC e é adicionado sobre o inóculo sem afetar, ou causar danos a bactéria. Dependendo de sua concentração os meios podem ser classificados quanto a consistência: - Líquido menos de 1g de ágar por litro de água - Semi-sólido 4 g/l - Sólido 15 a 18 g/l 43 Classificação quanto à função dos meios: -Seletivo -Diferencial -Enriquecedor -Rico -Transporte 44 22

23 Meios Seletivos Favorece o crescimento da bactéria de interesse impedindo o crescimento de outras bactérias. Inibidores: substâncias capazes de inibir algumas bactérias que não são de interesse. 1) Corantes: verde brilhante, eosina, cristal violeta... 2) Metais pesados: Bismuto; 3) Substâncias químicas: azida, citrato, desoxicolato, selenito e álcool feniletílico... 4) Agentes antimicrobianos: vancomicina, cloranfenicol 5) Meio hipertônico: alta concentração de sal (7,5%) 45 Meio Diferencial Utilizado para fácil detecção da colônia da bactéria de interesse quando existem outras bactérias crescendo na mesma placa do meio Substâncias utilizadas como indicadores de atividade enzimáticas que auxiliam na identificação -Indicadores de ph: fucsina, azul de metileno, vermelho neutro, vermelho de fenol e púrpura de bromocresol. Medem as variações de ph que resultam do metabolismo bacteriano de certos substratos. - Indicadores diversos: detectam produtos bacterianos específicos. Ex.: íons ferro e ferroso para a detecção de sulfato de hidrogênio 46 23

24 Indicadores de ph comumente usados em microbiologia Indicador ph ácido ph básico Andrade róseo amarelo Púrpura de bromocresol amarelo púrpura Azul de bromotimol amarelo azul Vermelho de ortocresol amarelo vermelho Vermelho de metila vermelho amarelo Vermelho neutro vermelho amarelo Vermelho de fenol amarelo vermelho 47 C.L.E.D. Cistina Lactose Eletrólitos - Deficiente Peptona...7 Extrato de levedura...2 Extrato de carne...2 Cistina...0,128 Lactose...10 Azul de Bromotimol...0,03 Ágar...12 Nitrogênio e carbono Açúcar Indicador de ph 48 24

25 CLED (Cistina Lactose- Eletrólitos-Deficientes) Com indicador azul de bromotimol Lactose + (Amarelo) Meio diferencial 49 CLED (Cistina Lactose- Eletrólitos-Deficientes) Com indicador de Andrade!! Lactose + (Rosa) Meio diferencial 50 25

26 Ágar MacConkey Peptona de carne...3 Peptona de caseína...17 NaCl...5 Lactose...10 Sais biliares...1,5 Vermelho neutro...0,03 Cristal violeta...0,001 Ágar...13,5 Nitrogênio e carbono Açúcar Inibidor de Gram+ Indicador de ph Inibidor de Gram+ 51 Meio Seletivo e Diferencial Muito utilizado na rotina laboratorial Ágar MacConkey Seletivo e Diferencial Seletivo: Cristal violeta e sais biliares inibem bactérias Gram-positivo; Diferencial: Este meio possui indicador de ph, por exemplo vermelho neutro: quando o meio fica ácido a cor fica rosa. Possui lactose que a bactéria pode degradar (fermentar) produzindo ácido que diminui o ph do meio

27 Lactose + Lactose - MacConkey Cultura mista!!!!!! Seletivo para enterobactérias (Gram-negativo) a partir de fezes, urina, alimentos, água MacConkey Cultura mista!!!!!! 1. Lactose 2. Lactose + Sais biliares e cristal violeta inibem Gram-positivas Meio seletivo e diferencial 54 27

28 Ágar Manitol Hipertônico Peptona...10 Extrato de carne...1 NaCl...75 Manitol...10 Vermelho de fenol...0,025 Ágar...12 Nitrogênio e carbono Inibidor de algumas Gram+ e das Gram - carboidrato Indicador de ph Meio Seletivo e Diferencial 55 Ágar Manitol Hipertônico Manitol - Indicador Vermelho de fenol!!! Manitol + A degradação do manitol está relacionada com a patogenicidade, indicativo da presença de Staphylococcus aureus. Crescem apenas bactérias que suportam grande concentração de sal! 56 28

29 E.M.B. (Eosina Azul de metileno) Para isolamento de Enterobactérias (Gram negativo) Corantes inibem Gram-positivo Brilho verde metálico Escherichia coli??? Bactérias produtoras de ácidos fortes formam brilho verde metálico causado pela precipitação do corante nas colônias: SUGESTIVO de E. coli!!! Meio seletivo e diferencial 57 E.M.B. (Eosina Azul de metileno) Para isolamento de Enterobactérias (Gram negativo) Corantes inibem Gram-positivo Colônias pardo rósea Produtora de ácido fraco Ex: Enterobacter sp Meio seletivo e diferencial 58 29

30 Meios de Cultura Seletivo: Favorece o crescimento do microrganismo de interesse e impede o crescimento de outros. Ex.: Ágar sulfeto de bismuto para isolamento de Salmonella typhi a partir das fezes. Meios Diferencial: Permite a fácil identificação da colônia da bactéria de interesse, dentre as colônias de outras bactérias crescidas no meio. Ex.: Meio ágar sangue para detectar a presença de Streptococcus pyogenes (forma-se um halo claro em torno da colônia pela lise das hemáceas) 59 Meio de enriquecimento Incrementa o crescimento de certas espécies bacterianas ao mesmo tempo que inibe o desenvolvimento de microrganismos que não sejam de interesse

31 Caldo selenito e Caldo GN Partem do princípio de que a E. coli e outros Gram-negativos da microbiota normal são mantidos em fase de latência (Lag) prolongada pelas substâncias químicas inibidoras. As espécies de Salmonella e Shigella são menos inibidas, entram em uma fase de crescimento exponencial (Log) e são isoladas com mais facilidade de amostras fecais. 61 Caldo GN Triptose...20 Glicose...1 Manitol...2 Hidrogenofosfato potássico...4 NaCl...5 Citrato de sódio...5 Desoxicolato de sódio...0,5 Base nutritiva!! carboidrato carboidrato Tampão Inibidores de Gram

32 Caldo selenito e Caldo GN Incubação de no máximo 8 horas Meio seletivo X.L.D. ou Hektoen ou SS 63 Ágar SS (Salmonella/Shigella) Peptonas...10 Lactose...10 Bile de boi dessecada... 8,5 Citrato de sódio...10 Tiossulfato de sódio...8,5 Citrato de amônio e ferro III...1 Verde brilhante...0,0003 Vermelho neutro...0,025 Ágar...12 Nitrogênio e carbono carboidrato Inibidores de Gram+ e algumas Gram - Indicador de H 2 S Indicador de ph 64 32

33 Ágar SS (Salmonella/Shigella) Salmonella sp Lactose - (Transparente) Produção de H 2 S (Com centro negro) Meio Seletivo e diferencial: verde brilhante, bile e alta concentração de tiossulfato e citrato inibem a microbiota acompanhante de fezes, alimentos e outros materiais. Lactose + E. coli - cor rosa 65 Rico X Enriquecimento Rico: é o meio que é suplementado com sangue, soro, suplementos vitamínicos e extrato de levedura para isolar microrganismos exigentes. Ex: ágar Mueller Hinton suplementado com 5% de sangue de carneiro e ágar chocolate Meio de enriquecimento: Incrementa o crescimento de certas espécies bacterianas ao mesmo tempo que inibe o desenvolvimento de microrganismos que não sejam de interesse. Ex.: Caldo GN e Caldo selenito

34 Ágar Mueller Hinton suplementado com sangue de carneiro a 5%. Meio rico Permite o crescimento da maioria das bactérias Colônia Hemólise 67 Meios de Cultura Seletivo: Favorece o crescimento do microrganismo de interesse e impede o crescimento de outros. Ex.: Ágar sulfeto de bismuto para isolamento de Salmonella typhi a partir das fezes. Meios Diferencial: Permite a fácil identificação da colônia da bactéria de interesse, dentre as colônias de outras bactérias crescidas no meio. Ex.: Meio ágar sangue para detectar a presença de Streptococcus pyogenes (forma-se um halo claro em torno da colônia pela lise das hemáceas) de Enriquecimento: Semelhante ao seletivo, mas suplementado por nutrientes especiais, com a característica de aumentar o número da bactéria de interesse tornando-a detectável

35 Meio de transporte Stuart Mantem o microrganismo viável, mas impede o crescimento e multiplicação até o subcultivo em meio adequado. Glicerol fosfato de sódio...10 Tioglicolato de sódio...1 Cloreto de cálcio...0,1 Azul de metileno...0,002 Ágar Microrganismos em meio de cultura 70 35

36 Meio Mueller Hinton Pseudomonas aeruginosa Pigmento verde natural Escherichia coli Brilho verde metálico somente no meio EMB! Meio EMB Serratia marcescens Pigmento vermelho natural!! 71 Momento I Aprendendo Microbiologia com Poema e Poesia By Ilana Camargo 36

37 Encontro com uma Drag queen verde! Será que vai me notar? Se isso não ocorrer, não vou chorar, nem tampouco esporular! Sou mesófilo e sempre estou com você. No seu calor me sinto bem. Vou crescer, você vai ver!! Pode até me cortar o oxigênio, como sou anaeróbio facultativo, vou continuar a crescer, Oh! Gênio! Porém, se no meu meio jogar sal, me inibirá e te deixarei... Não sou halófilo, afinal! Se você quiser me ver, me semeie em EMB e vou aparecer. Fermento lactose e ácido forte pode ser observado. Assim, como uma Drag queen verde, por todos posso ser notado. Sou bacilo Gram Negativo. Meu nome é Escherichia coli, e nosso encontro pode ser divertido! 73 37