Dissolver (1 a 1 com agitação; aquecer se necessário) Ajustar ph (se necessário) Distribuir em tubos ou frascos. Cozer. Distribuir em tubos

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1 Preparação de meios de cultura Pesar constituintes Biologia Microbiana Dissolver (1 a 1 com agitação; aquecer se necessário) Ajustar ph (se necessário) Adicionar agar Distribuir em tubos ou frascos Autoclavar Cozer Distribuir em tubos Autoclavar Filtração = 0.45 µm Autoclavar Plaquear Solidificar em posição inclinada Solidificar em posição vertical Meios sólidos Meios líquidos Embora existam numerosos meios de cultura os seus ingredientes essenciais são relativamente pouco numerosos. Constituintes essenciais para uma bactéria heterotrófica (E. coli): sais inorgânicos, fontes de carbono e azoto tipicamente glucose e (NH4)2S4, tampão e um agente quelante como por exemplo o citrato ou EDTA. Meios de cultura: (i) composição química definida; (ii) complexos de composição química não definida baseados em hidrolizados proteicos; estes meios contêm uma mistura de produtos de degradação de proteínas como a caseína. s principais métodos de hidrólise são: (a) hidrólise ácida (HCl) - hidrólise completa de proteínas parcialmente purificadas, como a caseína e a gelatina; (b) hidrólise enzimática pela pepsina, pancreatina, tripsina ou papaína. A digestão enzimática produz hidrolizados parciais (Peptona, Triptona) que geralmente são mais eficientes para o crescimento do que os hidrolizados totais ou a mistura de aminoácidos. As culturas tendem a modificar o ph durante o crescimento, estas alterações podem ser minimizadas incluindo um tampão no meio. Agente solidificante: Agar - polissacárido que forma um gel com a água (ponto de fusão 100ºC, solidifica a 40º - 45ºC), resiste à digestão pela maioria dos microrganismos. NTA: o agar é hidrolizado em solução ácida após autoclavagem. Métodos de esterilização: 1 - Calor: (a) calor húmido: (i) autoclave; (ii) tindalização (aquecimento a 100ºC 10 min - morte das células vegetativas - incubação durante algumas horas a 0ºC para germinação dos esporos - o ciclo repete-se 2 a x); (iii) fervura; (iv) pasteurização - aquecimento a temperaturas <100ºC; (b) calor seco -estufa. 2 - Desinfectantes químicos - Filtração 4 - Irradiação

2 Colónias Morfologia Diâmetro Pigmentação Consistência pacidade Textura Forma Elevação Margem Morfologia da colónia Biologia Microbiana Células Morfologia - microscopia - Cocos Bastonetes Cocobacilos Isolados Cadeias Pares Tétradas Morfologia celular Endósporos Cápsulas Características microscópicas Dimensão: variável; podem formar uma colónia de tamanho limitado, independentemente do período de incubação; outras espalham-se à superfície do agar. Pigmentação: a coloração é variável. Consistência: seca, pulverulenta, húmida, viscosa. pacidade: opaca, translúcida, iridiscente. Textura: lisa, rugosa, granular, radiada, concentricamente zonada. Forma: punctiforme, circular, elíptica, tripartida. Elevação: plana, elevada, convexa, estratificada. Margem: inteira, filamentosa, ciliada, lobada s endósporos bacterianos são estruturas de resistência - células vegetativas de paredes espessadas formadas durante a esporulação, que são resistentes à radiação, agentes químicos, temperaturas extremamente elevadas, dessecação (Bacillus e Clostridium). Cápsula: camada de polissacáridos(por vezes proteínas) protege a célula bacteriana, muitas vezes associada com bactérias patogénicas porque serve como uma barreira contra a fagocitose.

3 Células - suspensões Contagem de células totais cfu contadas cfu por µl vol. = superfície contada (mm2 )* x profundidade da câmara (0,1 mm) x diluição 1 mm * = nº contados x 1/400 1 mm cfu/µl = = células contadas nº contados x 1/400 x 0,1 x 10 -D cfu contadas x 4000 x 10 D = N x 4 x 10 x 10 D nº contados cfu/ml = N x 4 x 10 6 x 10 D Vcamâra = 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm 400 quadrados pequenos (25 x 16 ) Vcontagem = 0,1/400 mm = 1/4 x 10 6 ml número total de células é geralmente determinado com o auxílio de uma câmara de contagem calibrada que é observada ao microscópio. Uma câmara típica tem uma depressão central, cuja superfície está dividida em quadrados de área conhecida.uma gota da suspensão bacteriana é colocada nesta superfície e coberta com uma lamela espessa. 9 quadrados - 1 quadrado = 1 mm2 - volume total = 0,9 mm.

4 Células - suspensões McFarland Standard No. 1.0% Barium chloride (ml) 1.0% Sulphuric acid (ml) Approx. cell density (1X10 8 ml) Células totais Escala de McFarland McFarland Scale No. Bacteria (x10 6 /ml) McFarland Standards are tubes labelled 1 through 10 and filled with suspensions of Barium salts. % Transmittance* Absorbance* *Wavelength of 600 nm Correlação com: - peso fresco - peso seco - células/ml - cfu/ml McF 0.5 Ec 0.5 SF Escala de McFarland - padrões de turbidez: BaCl2 1% e H2S4 1% em diferentes proporções de modo a formar suspensões turvas de BaS4. número de células de uma supensão bacteriana pode ser determinado em aproximação, por comparação com os padrões da escala de McFarland.

5 Biologia Microbiana Purificação por esgotamento do inóculo

6 PREPARAÇÃ DE UM ESFREGAÇ BACTERIAN 1 2 H 2 + bactérias Espalhar a mistura H 2 -bactérias 4 Secar ao ar Fixar pelo calor

7 Biologia Microbiana G+ G1 Esfregaço 2 Violeta Cristal = 1 min C L R A Ç Ã G+ G- 6 Álcool 95% até sair todo corante 7 de G R A M 4 Lugol = 1 min 8 Safranina = 1 min Secar c/ papel 11 As células são fixadas pelo calor e coradas com um corante básico, violeta cristal, que cora as células de azul; as preparações são depois tratadas com lugol que permite que o iodo penetre nas células e forme um complexo insolúvel em água com o violeta cristal. Este complexo é posteriormente eliminado com uma lavagem com alcool a 95% ou acetona, que solubilizam o complexo iodo-violeta cristal. Após o tratamento com o solvente apenas as bactérias gram + permanecem coradas, possivelmente devido à sua espessa parede celular, que não é permeável ao solvente. As células são então tratadas com um contracorante (safranina ou ácido fucsinico), para permitir a visualização das células gram - que se encontram descoradas. As células gram - aparecem coradas de vermelho e as gram + de azul (violeta).

8 CARÁCTER GRAM (Teste de KH %) 1 2 KH % + bactérias Misturar KH % + bactérias Gram negativa Gram positiva teste KH % (+) teste KH % (-) A parede das bactérias gram + é resistente à solução alcalina e por isso não ocorre lise celular. A parede das bactérias gram - não é resistente à solução alcalina e por isso ocorre lise celular; o DNA reage com o KH e há formação de um fio viscoso

9 TESTE DA CATALASE H 2 2 palitos 1 Peróxido de hidrogénio + bactérias 2 Misturar H bactérias catalase positiva (+) catalase 2 H H catalase negativa (-)

10 TMPD palitos TESTE DA XIDASE 1 2 papel de filtro + tetrametil parafenilenodiamina dihidrocloreto + bactéria Misturar bactérias + TMPD contra papel de filtro oxidase positiva (+) Células c/ coloração violeta (resultado imediato) xidação do TMPD Redução do citrocromo c oxidase negativa (-)

11 1 2 Esfregaço Bacillus sp. Papel de filtro + Verde malaquite C L R A Ç Ã de 5 6 Safranina = 1 min Biologia Microbiana 4 5 min s/ ferver E N D Ó S P R S 7 Secar c/ papel 8 Cobre-se o esfregaço com papel de filtro (para evitar a evaporação do corante) saturado com verde malaquite (corante para endósporos - não tem afinidade para as células vegetativas). Aquece-se à chama 5 min sem deixar secar o papel de filtro para auxiliar a penetração do corante nos endósporos.