CRESCIMENTO MICROBIANO -mais detalhes- Prof. IVAnéa

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1 CRESCIMENTO MICROBIANO -mais detalhes- Prof. IVAnéa

2 Crescimento Microbiano

3 CRESCIMENTO MICROBIANO: Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares. Crescimento Microbiano = associado ao crescimento de uma população de células (uma célula dará origem a duas ao fim de um certo tempo, tempo de geração ou de duplicação.)

4 Fatores físicos

5 1. TEMPERATURA: A maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres humanos. Temperatura de crescimento mínima: Temperatura de crescimento ótima: Temperatura de crescimento máxima: Temperatura onde a espécie é capaz de crescer onde a espécie apresenta melhor crescimento temperatura, onde ainda é possível o crescimento Figura 1. Taxa de crescimento vs. temperatura

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7 Bactéria: Bacillus cereus Respiração: aeróbico facultativo Incubação: 1-6 horas (casos de vomito) 6-24 (casos de diarréia) Principais Alimentos Associados: arroz cozido Observações: produz esporos e toxinas Bactéria: Clostridium botulinum Respiração: anaerobico Incubação: horas Principais Alimentos Associados: alimentos em conservas e embutidos de carne Observações: produz esporos e toxinas termolábeis Bactéria: Clostridium perfringens Respiração: anaerobico Incubação: horas Principais Alimentos Associados: carnes aquecidas e reaquecidas em temperaturas inadequadas Observações: produz esporos e toxinas comum em alimentos servidos em escolas, hospitais e presídios Bactéria: Listeria monocytogenes Respiração: aerobica Incubação: 3 semanas Principais Alimentos Associados: derivados lacteos, frutos do mar e ostras Observações: nao forma esporos mas é resistente ao congelamento, secagem e calor Bactéria: Staphyloccus aureus Respiração: aeróbico Incubação: 2-4 horas Principais Alimentos Associados: alimentos com alto grau de manipulação que permaneçam por muito tempo em temperatura ambiente Observações: produz toxina termoestavel Bactéria: Streptococcus spp (grupo A e D) Respiração: aerobico Incubação: grupo A 1-3 dias horas, grupo D 2-36 horas Principais Alimentos Associados: leite não pasteurizados e alimentos preparados por pessoas infectadas Observações: Grupo A causa faringite estreptococica, Grupo D causa a sindrome semelhante a Staphylococcus

8 Microrganismos são classificados em 3 grupos: Psicrófilos: Mesófilos: Termófilos: Termófilos extremos crescem em baixas temperaturas (-10 a 15 C) crescem em temperaturas moderadas (10 a 50 C) crescem em altas temperaturas (40 a 70 C) Temperaturas (68 a 110 C)

9 Figura 2. Curva de crescimento característica de diferentes microrganimos

10 2. ph: Refere-se a acidez ou a alcalinidade de uma solução; Maioria dos microrganismos cresce melhor perto da neutralidade (ph 6,5 7,5); Poucas bactérias são capazes de crescer em ph ácido (como ph 4,0) Exceções: Bactérias acidófilas: alto grau de tolerância à acidez (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5) - Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (ph 10 11). Fungos - tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (ph <5).

11 3. PRESSÃO OSMÓTICA Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença no meio. Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio. Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações. Figura 3. Taxa de crescimento de alguns microrganimos vs. a concentração de sal.

12 Fatores Quimicos

13 1. FONTES DE CARBONO, NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO: CARBONO: Essencial para a síntese de todos os compostos orgânicos necessários para a viabilidade celular (elemento estrutural básico para os seres vivos) organismos quimio-heterotróficos: obtém C a partir de materiais orgânicos como proteínas, carboidratos e lipídeos. organismos quimioautotróficos organismos fotoautotróficos

14 NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO: NITROGÊNIO Obtenção de N: - N, S: síntese de proteínas Decomposição de materiais orgânicos (proteínas, aminoácidos) - N, P: síntese de DNA e RNA, ATP utilizado para sintetizar os grupos aminos presentes nos aminoácidos. Amônia (NH4 + ) Peso seco de uma célula bacteriana: 14 % N, 4 % S, P Nitrato (NO 3- )

15 Fixação de N: algumas bactérias são capazes de utilizar N gasoso diretamente da atmosfera. Microrganismos do solo (ex. bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium) utilizam este processo para obtenção de N, tanto para elas como para as plantas que convivem simbioticamente (algumas leguminosas soja, feijão). Cultivo de leguminosas: > fertilidade do solo sem a necessidade de implementação de fertilizantes químicos

16 1. FONTES DE CARBONO, NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO: ENXOFRE utilizado na síntese de aminoácidos contendo S e de vitaminas (tiamina e biotina) FÓSFORO essencial para a síntese dos ácidos nucléicos e para os fosfolipídios componentes da membrana celular.

17 2. ÁGUA: Essencial para os microrganismos - Disponibilidade variável no ambiente Ambiente com < concentração de água: Desenvolvem mecanismos para obter água através do aumento da concentração de solutos internos seja pelo bombeamento de íons para o interior celular ou pela síntese de solutos orgânicos (açúcares, alcoóis ou aminoácidos).

18 3. OXIGÊNIO: Extremamente importante no desenvolvimento microbiano Os organismos classificados em: 1. AERÓBIOS Estritos (obrigados): necessitam de O 2 Facultativos: não necessitam de O 2 mas crescem melhor com O 2 Microaerófilo: necessitam de O 2 mas em níveis menores 2. ANAERÓBIOS Aerotolerantes: não necessitam de O 2 mas crescem melhor sem O 2 Estritos (obrigados): não toleram O 2 (letal)

19 AERÓBIO ESTRITOS ANAERÓBIO ESTRITO AERÓBIO FACULTATIVO MICRO AERÓFILO ANAERÓBIO AEROTOLERANTES Catalase e a superóxido dismutase reduzem para H 2 O os compostos tóxicos. alta [O 2 ] catalase SOD sem O 2 ausência: catalase SOD alta e baixa [O 2 ] catalase SOD baixa [O 2 ] alta e baixa [O 2 ] SOD Figura 4. Efeito do oxigênio sobre o crescimento de vários tipos de bactérias.

20 Meios de cultura

21 meio de cultura: material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de microrganismos. cultura: microrganismos que crescem e se multiplicam no meio de cultura. meio definido: toda a composição química é conhecida meio complexo: composição química não conhecida (composto por nutrientes como extrato de levedura, de carne ou de plantas)

22 MEIO SELETIVO: favorece o crescimento de uma determinada bactéria de interesse, impedindo o crescimento de outras bactérias. ex: ágar sabouraud dextrose, ph 5,6, é utilizado no crescimento de fungos que são favorecidos, em relação as bactérias, pelo baixo ph. MEIO DIFERENCIAL: facilita a identificação de um determinado organismo. ex: meio ágar-sangue, utilizado para a identificação de bactérias capazes de destruir células sangüíneas (anel claro em torno da colônia). MEIO DE ENRIQUECIMENTO: favorece o desenvolvimento de uma população bacteriana que esta em desvantagem entre outras populações. MEIOS REDUTORES: meios com reagentes, como o tioglicolato de sódio, que é capaz de se combinar com o oxigênio dissolvido eliminando este elemento do meio de cultura (específico para microrganismos anaeróbicos).

23 DIVISÃO BACTERIANA: CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS FISSÃO BINÁRIA TEMPO DE GERAÇÃO FASES DE CRESCIMENTO: FASE lag FASE log FASE ESTACIONÁRIA FASE DE MORTE CELULAR Figura 5. Fissão binária bacteriana.

24 É o tempo necessário para uma célula se dividir (e sua população dobrar de tamanho). tempo varia de acordo com o organismo; depende das condições ambientais (nutricionais, temperatura, etc); maioria das bactérias: 1 3 h

25 FASE lag: Pouca ou ausência de divisão celular (fase de adaptação) - 1 hora (estado de latência, com intensa atividade metabólica) FASE log: Início do processo de divisão (período de crescimento ou aumento logaritmo). Reprodução celular extremamente ativa, sensíveis as mudanças ambientais (* EFEITO DE ANTIBIÓTICOS) FASE ESTACIONÁRIA: Velocidade de crescimento diminui o nº de células vivas = nº de células mortas FASE DE MORTE CELULAR: O nº de células mortas excede o de células novas. Figura 6. Curva de crescimento bacteriano mostrando as 4 fases típicas.

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27 QUANTIFICAÇÃO DIRETA: CONTAGEM EM PLACAS FILTRAÇÃO MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: TURBIDIMETRIA ATIVIDADE METABÓLICA PESO SECO

28 QUANTIFICAÇÃO DIRETA:

29 CONTAGEM EM PLACAS técnica mais utilizada na determinação do tamanho da população bacteriana; VANTAGEM: qualificação de células viáveis DESVANTAGEM: tempo (24 h para o aparecimento das colônias) Cálculo: nº de colônias na placa x índice de diluição da amostra = nº de bactérias/ml DILUIÇÃO SERIADA MÉTODO DE ESPALHAMENTO EM PLACA

30 Figura 7. Contagem em placas e diluição seriada

31 (2) FILTRAÇÃO nº de bactérias = pode ser utilizado o método de filtração para a sua contagem. concentração de bactérias sobre a superfície de uma membrana de filtro de poros muito pequenos após a passagem de um volume de 100 ml de água. filtro posteriormente transferido para uma placa de Petri contendo meio sólido.

32 (3) O MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) utilizado para microrganismos que não crescem bem em meio sólido. A) diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 ml) B) diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 ml) c) diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 ml) d) contagem do nº de tubos positivos e) estimativa do nº de células/ml de bactérias

33 Figura 8. Método do número mais provável (NMP)

34 6 3 1 Figura 8. Método do número mais provável (NMP)

35 (4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em uma área definida da lâmina de microscópio. a amostra pode ser corada ou analisada a fresco. utilizam câmaras de contagem DESVANTAGENS: não separa células mortas e vivas pode haver erros de contagem difícil contagem para bactérias móveis Figura 9. Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser.

36 QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:

37 (1) TURBIDIMETRIA monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez espectrofotômetro ( nm) (2) ATIVIDADE METABÓLICA quantidade de um certo produto (como ácido ou CO 2 ) é diretamente proporcional ao número de células bacterianas.

38 A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº. de bactérias. Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida Figura 10. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria.

39 (3) PESO SECO principalmente para fungos filamentosos a) fungo é removido do meio por filtração b) seco em dessecador c) posterior pesagem

40 Agora laboratório