NUTRIÇÃO E CULTIVO DE MICRORGANISMOS. Introdução. Nutrição microbiana 16/04/2009. Fornecimento de nutrientes Síntese de macromoléculas

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1 NUTRIÇÃO E CULTIVO DE MICRORGANISMOS Verônica Ortiz Alvarenga Introdução O termo crescimento refere-se ao aumento do número de microrganismos presentes na população. Este aumento é obtido através de divisão binária, processo em que uma célula dá origem a duas outras pela separação do material celular em duas metades equivalentes Nutrição microbiana Fornecimento de nutrientes Síntese de macromoléculas 1

2 Exigências Nutricionais ÁGUA Essencial para os microrganismos: absorção nutrientes dissolvidos Disponibilidade variável no ambiente Se ambiente possui < concentração de água: célula aumenta Concentração de solutos internos (bombeamento de íons para o interior Celular ou pela síntese de solutos orgânicos) Exigências Nutricionais ENERGIA Exigências Nutricionais Tipo Fonte de Energia Fonte de Carbono Fotolitotrófico (ou Luz CO 2 fotoautotrófico) Fotoorganotrófico (ou fotoheterotrófico) Luz Composto orgânico Quimiolitotrófico (ou quimioautotrófico) Quimioorganotrófico (ou quimioheterotrófico) Oxidação de composto CO 2 químicos inorgânicos Oxidação de composto Composto orgânico químico orgânicos 2

3 Exigências Nutricionais CARBONO todos os organismos requerem alguma forma de carbono esqueleto das 3 maiores classes de nutrientes orgânicos : lipídeos,carboidratos e proteínas: fornecem energia para o crescimento e servem como unidade básica para biossíntese heterotróficos utilizam compostos orgânicos como fonte de carbono autotróficos utilizam o CO 2 como fonte de carbono Exigências Nutricionais NITROGÊNIO todos os organismos necessitam em alguma forma parte essencial dos aminoácidos (proteínas) e ácidos nucléicos bactérias são mais versáteis para N que eucariotos podem utilizar o N2 (fixação biológica), nitratos, nitritos e sais de amônia em geral compostos nitrogênio orgânico: aminoácidos e peptídeos Exigências Nutricionais ENXOFRE, HIDROGÊNIO E FÓSFORO essenciais a todos os organismos S é necessário na biossíntese de cisteína, cistina, metionina e de vitaminas (tiamina e biotina) P é essencial para a síntese de ácidos nuclêicos e ATP sais inorgânicos (sulfatos e fosfatos) podem ser utilizados para suprir estes elementos também presentes em fontes protêicas (aa), DNA e RNA alguns destes elementos são encontrados na água ou na atmosfera 3

4 Exigências Nutricionais POTÁSSIO, MAGNÉSIO, CÁLCIO E FERRO K, Mg cofatores enzimático Ca estabilização parede celular e formação de endosporos Fe faz parte dos citocromos, e proteínas transporte elétrons Exigências Nutricionais MICRONUTRIENTES OU ELEMENTOS TRAÇO: Co, Cu, Ni, Mo, Mn, Se, Zn, Cr necessários em concentração muito baixa (µg/l) cofatores de enzimas geralmente não é preciso adicionar: presentes na água se água desmineralizada: adicionar solução elementos traços Exigências Nutricionais FATORES DE CRESCIMENTO: compostos orgânicos: vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas muitas vitaminas (tiamina, biotina, cobalamina) atuam como coenzimas alguns m.o. não sintetizam os fatores que devem ser disponíveis no meio 4

5 Temperatura importante, pois os microrganismos não possuem qualquer mecanismo de controle interno deste fator, o que pode afetar as reações químicas da célula. Psicrófilos: ou microrganismos que crescem em baixas temperaturas (7-20ºC); Mesófilos: ou microrganismos que crescem em temperaturas moderadas (25 40ºC); Termófilos: ou microrganismos que crescem em altas temperaturas; Baseado nesta temperatura tem-se os seguintes grupos: Hipertermófilos: toleram ou crescem em temperatura de 100 o C ou mais Psicrotróficos: não possuem um ótimo de temperatura. Crescem a 7 o C ou menos, alguns crescem abaixo de 0 o C e outros podem crescer em temperaturas entre 37 e 45 o C; 5

6 Exigências atmosféricas os microrganismos podem ser divididos, ainda, de acordo com o seu requerimento em oxigênio e gás carbônico. Aeróbios obrigatórios: são microrganismos que, para crescerem e se multiplicarem, necessitam de uma atmosfera que contenha O 2 em uma concentração equivalente ao ar atmosférico (20-21%). Ex: micobactérias, fungos filamentosos (bolores); Microaerófilas: o oxigênio requerido para multiplicação é menor do que aquele encontrado no ar atmosférico (cerca de 5% de O 2 ) Ex: Espécies de Campylobacter, causadora da diarréia; Anaeróbios estritos: crescem somente na ausência total de oxigênio. Ex.: Clostridium botulinum; Anaeróbios facultativos: crescem tanto na presença como na ausência de oxigênio. Ex.: Enterobactérias, estreptococos e estafilococos; Anaeróbios aerotolerantes: não requer oxigênio e cresce melhor na sua ausência, mas pode sobreviver em atmosferas que contenham o mesmo. Ex.: Lactobacilos. 6

7 Culturas de microrganismos mostrando na seqüência aeróbios, anaeróbios estritos, anaeróbios facultativos, microaerófilos e anaeróbios aerotolerantes. Fonte: Brock et al. (1991). O 2 é poderoso agente oxidante e excelente aceptor de elétrons na respiração Processos celulares geram formas reativas de O 2 Espécies reativas são oxidantes poderosos que destroem constituintes celulares células devem ser capazes de se proteger contra estas espécies reativas para manter sua integridade. 7

8 Superóxido dismutase (SDO) e catalase são as enzimas mais importantes Presença de catalase é variável aeróbios, facultativos, microaerofílicos e aerotolerantes possuem SDO Anaeróbios estritos não possuem estas enzimas e portanto não conseguem sobreviver na presença de oxigênio 8

9 O envelope de Gaspak gera através de adição de água H 2 e CO 2 Jarra é fechada e O 2 presente é removido por reação com o H 2 catalisada pelo paládio formando água usada para anaeróbios aerotolerantes 9

10 Exigência em Gás carbônico Algumas bactérias crescem melhor na presença de concentrações aumentadas de CO 2, tais organismos são chamados de capnofílicos. Ex.: Campylobacter. ph fator limitante do crescimento microbiano. A maioria das bactérias cresce bem em meios com ph ao redor de 7,0 Muitas espécies tolerarem variações de ph entre 4,0 e 9,0 Ótimo de crescimento se localiza entre 6,5 e 7,5. Poucas bactérias podem se desenvolver abaixo de ph 4,5-5,0 mas esses são os limites preferidos pelos fungos e leveduras. ph Thiobacillus thiooxidans que transforma o enxofre em ácido sulfúrico, e cresce bem a ph 1,0 Vibrio comma, agente causador da cólera asiática, que desenvolve a ph 10,0. 10

11 Pressão Osmótica meios de cultura com pressões osmóticas inferiores da célula, geralmente não afetam sua viabilidade que a rigidez da parede celular impede a entrada excessiva de água. Entretanto, meios de cultura com pressões osmóticas mais elevadas causam a perda de água intracelular, podendo ter efeito bacteriostático ou bactericida. Isotônico - onde a concentração de solutos em um meio é igual àquela no interior da célula. Não há movimento de água para dentro e para fora da célula Hipertônico - concentração de solutos fora da célula é maior que no interior. A água flui para fora da célula resultando na desidratação e contração da célula Hipotônico - a concentração de soluto no interior da célula é maior que fora dela. A água flui para dentro da célula: pode inchar e se romper - plasmólise Outras Exigências Halofílicos crescem melhor em concentrações aumentadas de sais. Geralmente as bactérias crescem em concentrações de 0,9 %. Bactérias Halófilas facultativas (2 a 15% de NaCl) Bactérias Halófilas extremas (30% de sal) Xerofílicos crescem melhor em ambientes mais secos, com menor teor de água. Osmofílicos crescem melhor em ambientes com altos teores de açúcares. 11

12 Meio de cultura preparação contendo os nutrientes necessários para cultivar e manter microrganismos viáveis em laboratório. Duas grandes classes de meios de cultura Meio definido ou sintético: composição química exata é conhecida Meio complexo: composição química exata não é conhecida (composto por extratos naturais de carne, levedo, proteínas hidrolisadas) 12

13 Substratos para meios complexos: Extrato de Carne: extrato aquoso de tecido muscular, concentrado sob a forma de pasta, contém carboidratos, N orgânico, vitaminas hidrossolúveis e sais. Peptona: produto da digestão da carne (enzimática ou ácida), fonte de N orgânico e vitaminas. Triptona: hidrolisado pancreático de carne, rica em nitrogênio-amínico; destinado ao isolamento de organismos de difícil crescimento. Substratos para meios complexos: Extrato de Levedura: extrato aquoso de células de leveduras lisadas, fonte excelente de substâncias estimulantes do crescimento como vitamina complexo B; contém compostos orgânicos de N e C. Extrato de malte: extrato aquoso de cevada malteada. Rica em carboidratos, contém material nitrogenado, vitaminas e sais minerais. Tripticase: peptona derivada da caseína por digestão pancreática,fonte rica em nitrogênio de aminoácidos. 13

14 Meios complexos são altamente nutritivos geralmente mais fáceis de preparar são os mais usados ( composição exata não é necessária) mais adequados para fastidiosos Quanto ao estado físico os meios podem ser: líquidos: (caldos) nutrientes são dissolvidos em água e esterilizados sólidos: são preparados a partir da adição, ao meio líquido de um agente solidificante, antes da esterilização do meio. ágar-ágar: polissacarídeo obtido de algas marinhas. Usado como agente solidificante dos meios. Funde a 100 C e gelifica qua ndo a temperatura é menor de 45 C. Concentração 1,5-2% p/v. Não serve como nutriente!!!! semi-sólidos: obtido através da adição de uma quantidade reduzida de agente solidificante (0,3 a 0,5% de ágar) Meios líquidos: multiplicação celular ; processos industriais em reatores Meios sólidos: usados para imobilização de m.o. em placas ou tubos aparecimento de massas celulares: colônias Colônia: originada da multiplicação de m.o. em meio sólido importante para a caracterização dos m.o. para colônia ser visível : 1 x 10 6 células são isolados em meios sólido visando obtenção de culturas puras Cultura pura: contém um único tipo de m.o. sem contaminantes 14

15 Meios de cultura com finalidades especiais Meios Seletivos permitem crescimento de um tipo particular de microrganismo suprimindo o desenvolvimento de outros ágar Sabouraud: ph 5,6 e alta concentração de glicose (seletivo para fungos) ágar verde brilhante: seletivo para enterobactérias Gram - (Salmonella); o corante verde brilhante adicionado ao meio inibe as bactérias Gram (+) Adição de antibióticos: seletivos para os m.o. resistentes à estes agentes antimicrobianos 15

16 Meios de cultura com finalidades especiais Meios de cultura com finalidades especiais Meios diferenciais : permitem a distinção entre diferentes grupos de m.o. Produção de enzimas: adição substrato e verificação halo hidrólise Hemólise em ágar sangue: Streptococcus e Staphylococcus hemolíticos Meios de cultura com finalidades especiais 16

17 Meios de cultura com finalidades especiais Meios Seletivos/Diferenciais agem como seletivos e diferenciais muito úteis no diagnóstico de patogênicos (coliformes fecais) Ex: ágar MacConkey - contém sais biliares e corante cristal violeta, que inibem o crescimento de Gram + e permitem o desenvolvimento de Gram - e ainda lactose e o indicador vermelho neutro, que distingue as Gram negativas produtoras de ácido (vermelhas) das Gram negativas não produtoras de ácido (amarelas) identificação de coliformes Meios de cultura com finalidades especiais Meios de cultura com finalidades especiais Meios de Enriquecimento usados para selecionar microrganismo presente em pequenas quantidades em relação à população de um ambiente. favorece o crescimento da espécie desejada, mas não o crescimento das outras espécies presentes em uma população mista Ex: isolamento de bactérias que oxidam o fenol - podem ser isoladas de amostras do solo, utilizando meio de enriquecimento, contendo sais de amônia, e fenol como única fonte de carbono e energia somente os microrganismos capazes de oxidar o fenol estarão presente em grande número depois de vários cultivos 17

18 Meios de cultura com finalidades especiais Meios de Estocagem utilizado para a manutenção da viabilidade e das características fisiológicas de uma cultura meio diferente do ótimo para o crescimento - desenvolvimento rápido: morte rápida a glicose favorece o crescimento, preferível omiti-la na preparação de um meio de estocagem. 18