Crescimento/Multiplicação

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1 SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL Instituto Federal de Alagoas - Campus Piranhas ENGENHARIA AGRONÔMICA Crescimento/Multiplicação Prof.(a) Juliana Moraes Piranhas 2017 Fatores influenciadores Fatores Físicos Químicos Temperatura ph Nutrientes 1

2 FATORES FÍSICOS TEMPERATURA Faixa de temperatura de Crescimento (máxima e mínima) Temperatura ótima de crescimento Classificação: Psicrófilos crescem em baixas temperaturas crescem a 0 C temperatura ótima 15 C Psicrotróficos crescem em baixas temperaturas crescem a 0 C temperatura ótima 20 a 30 C Mesófilos crescem em temperaturas moderadas Maioria dos microrganismos deteriorantes e patógenos Temperatura ótima entre 25 e 40 C 2

3 Termófilos crescem em altas temperaturas Temperatura ótima entre 50 e 60 C Hipertermófilos ou termófilos extremos crescem em temperaturas muito altas Temperatura ótima de 80 C ou mais 3

4 ph Bactérias = A maioria crescem em ph perto da neutralidade 6,5 e 7,5. Poucas bactérias crescem abaixo de ph 4,0 Bactérias acidófilas resistentes a ph ácidos. Fungos = maioria crescem em ph mais baixos do que os requeridos pelas bactérias, geralmente entre 5,0 e 6,0. Formação de ácido = metabolismo microbiano Meios de cultivos adicionados de tampões (peptona e aminoácidos) par controlar a acidez do meio e evitar inibição dos microrganismos. 4

5 Pressão osmótica Obtenção de nutrientes a partir da água Composição da célula: 80 a 90% de água Pressão osmótica (entrada e saída de solvente da célula) Ambiente hipertônicos plasmólise celular: perda de água do meio intracelular e separação da membrana plasmática (MB) e parede celular (PC) Ambiente hipotônicos Lise celular: entrada de água do meio extra para o intracelular podendo gerar ruptura da membrana em celular com paredes celulares mais frágeis. Separação MB e PC impedem o crescimento (multiplicação) microbiana. Conservação de alimentos (adição de solutos/sais) Halófilos extremos adaptados as altas concentração de sais para o crescimento Halófilos obrigatórios: requerem altas concentrações de sais (alguns até 15% a 30%) Halófilos facultativos: suportam concentrações de até 2% 5

6 FATORES QUÍMICOS Nitrogênio Elementos traços Nutrientes Enxofre Carbono Fósforo 6

7 Oxigênio Classificação de acordo com o crescimento na concentração de oxigênio do meio: AERÓBIOS Fazem uso do oxigênio para a produção de energia / Alto rendimento energético AERÓBIOS ESTRITOS OU OBRIGATÓRIO: somente sobrevivem em ambientes contendo oxigênio ANAERÓBIOS Produção de energia na ausência de oxigênio / Baixo rendimento energético ANAERÓBIO FACULTATIVO: somente sobrevivem tanto em ambientes contendo oxigênio como em ambientes que possuem oxigênio (vantagem evolutiva) ANAERÓBIOS ESTRITOS OU OBRIGATÓRIOS: somente sobrevivem em ambiente ausentes de oxigênio. ANAERÓBIO AEROTOLERANTES São anaeróbios, porém conseguem crescem na presença de oxigênio. MICROAERÓFILOS Crescem em concentrações de oxigênio menores que a concentração normal do ar atmosférico (17%). 7

8 O crescimento na presença de oxigênio produz formas moleculares do oxigênio toxicas. Oxigênio Singlet Radicais superóxidos Peróxido de hidrogênio Forma molecular de oxigênio que energizada e por isso tornou-se altamente reativa. Superóxido-dismutase (SOD) Neutralização dos radicais Catalase Neutralização dos peróxidos 8

9 BIOFILMES Biofilme Forma de vida de células microbianas: Planctônicas: vida livre Sésseis: vida em comunidade Células cobertas por uma camada extracelular de polissacarídeos (Matriz) A matriz é compostas por água, proteínas, carboidratos e acido nucléicos. Comunicação entre as células da comunidade - quorum sensing (comunidade biológica funcional organizada). Adesão em superfícies bióticas e abióticas Célula planctônica Adesão (reversível) Biofilme Biofilme maduro (irreversível) 9

10 Biofilmes Benefícios Malefícios Tratamento de resíduos Sistema digestório de ruminantes Risco de saúde pública Danos de tubulações industriais A vida em comunidade oferece aos microrganismos que compõem o biofilme x mais resistência a antibióticos e agentes sanitizantes. 10

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12 Fatores orgânicos de crescimento Os compostos orgânicos essenciais que um organismo é incapaz de sintetizar são conhecidos como fatores orgânicos de crescimento. Eles devem ser obtidos diretamente do ambiente. Muitas bactérias podem sintetizar suas próprias vitaminas e não dependem de fontes externas. Contudo, algumas bactérias não possuem as enzimas necessárias para a síntese de certas vitaminas que são para elas fatores orgânicos de crescimento. Outros desses fatores requeridos por certas bactérias são aminoácidos, purinas e pirimidinas. 12

13 MEIO DE CULTURA Conceitos Meio de cultura ou meio de cultivo: mistura de nutrientes orgânicos e inorgânicos utilizados para observar o crescimento microbiano em laboratório. Inóculo: quantidade de microrganismos adicionados no meio de cultivo para o crescimento Cultura: microrganismos que crescem em um meio de cultivo após a manutenção em condições ambientais adequada. Usados para identificar, identificar e enumerar microrganismos de interesse Estéril: livre de microrganismos 13

14 Classificação forma MEIOS DE CULTURA SÓLIDOS Contém agente solidificante: ágar Ágar: é um polissacarídeo complexo derivado de uma alga marinha, Características: Poucos micro-organismos podem degradar o ágar, o que permite que ele permaneça solido. Se liquefaz a cerca de 100 C (o ponto de ebulição da agua) e ao nível do mar ele permanece liquido ate a temperatura diminuir até cerca de 40 C. MEIOS DE CULTURA LÍQUIDOS Não possui agente solidificante: ágar Para utilização no laboratório, o ágar mantido em banho-maria a 50 C. Nessa temperatura, ele não destrói a maioria das bactérias quando adicionado sobre elas. 14

15 Classificação composição MEIOS DE CULTURA COMPLEXOS aquele cuja composição exata e conhecida. Para um quimio-heterotrofico, o meio quimicamente definido deve conter fatores de crescimento orgânicos que servem como fonte de carbono e energia. MEIOS DE CULTURA QUIMICAMENTE DEFINIDOS feitos de nutrientes como extratos de leveduras, de carnes ou de plantas, ou produtos de digestão destas ou de outras fontes. A composição química exata varia um pouco de acordo com o lote. Classificação finalidades MEIOS DE CULTURA SELETIVOS São elaborados para impedir o crescimento de bactérias indesejadas e favorecer o crescimento dos micro-organismos de interesse MEIOS DE CULTURA DIFERENCIAIS facilitam a diferenciação das colônias de um micro-organismo desejado em relação a outras colônias crescendo na mesma placa. De maneira similar, culturas puras de micro-organismos tem reações identificáveis com meios diferenciais em tubos ou placas. 15

16 OBTENÇÃO DE CULTURA PURA Isolamento Crescimento Microbiano método de esgotamento por estrias OBJETIVO: obter colônias isoladas 16

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22 PRSERVAÇÃO DE CULTURAS BACTERIANAS Congelamento Liofilização (congelamento e sublimação) - 50 C a - 95 C 54 C a -72 C 22

23 CRESCIMENTO DE CULTURA BACTERIANAS Divisão celular Divisão binária Brotamento*** 23

24 Tempo de Geração Tempo necessário para uma célula se dividir, ou mesmo, sua população duplicar. O tempo de geração é influenciado: Tempo Temperatura Condições ambientais Características da própria espécie 24

25 Representação logarítmica 25

26 Fases de Crescimento Fase LAG ou Fase de adaptação Período de pouca ou nenhuma divisão podendo durar de uma hora a vários dias. Durante esse tempo, contudo, as células não estão dormentes. A população microbiana passa por um período de intensa atividade metabólica, envolvendo principalmente a síntese de enzimas e varias moléculas. Fase LOG ou fase exponencial de crescimento as células começam a se dividir e entram em um período de crescimento, ou aumento logarítmico. A reprodução celular e mais ativa durante esse período, e o tempo de geração atinge um valor constante. Momento de maior atividade metabólica,. FASE ESTÁCIONÁRIA Se a fase de crescimento continua sem controle, ocorre a formação de um grande numero de células. Na realidade, isso não ocorre. No final do crescimento, a velocidade de reprodução se reduz, o numero de mortes microbianas é equivalente ao numero de células novas, e a população se estabiliza. A causa da interrupção do crescimento exponencial não e sempre clara. O esgotamento dos nutrientes, o acumulo de resíduos e mudanças no ph danosas a célula podem ser os motivos. FASE DE MORTE OU DECLÍNIO O numero de mortes finalmente ultrapassa o numero de células novas formadas. Essa fase continua ate que a população tenha diminuído para uma pequena fração da população da fase anterior ou morre totalmente. 26

27 Medidas de crescimento microbiano Quantificação de uma população normalmente é registrada como o numero de células por mililitro de liquido ou grama de material solido. Como as populações bacterianas geralmente são muito grandes, a maioria dos métodos de contagem tem como base enumerações diretas ou indiretas de amostras pequenas; um calculo determina depois o tamanho total da população. Direta Enumeração Indireta 27

28 Enumeração direta 11/20/2017 Contagem em placas Diluições seriadas Incorporação em placas a espalhamento em placas Filtração Numero mais provável (NMP) Microscópica direta Contagem em placas Vantagem: mede o numero de células viáveis. Desvantagem: são necessárias 24 horas ou mais para que colônias visíveis sejam formadas. Unidade Formadora de colônia (UFC) Quando uma contagem em placas e feita, é importante que somente um numero limitado de colônias se desenvolva na placa. Quando muitas colônias estão presentes, algumas células são reprimidas e não podem se desenvolver (imprecisão na contagem). Para evitar imprecisão: contagem de placas com somente 25 a 250 colônias (FDA recomendação) 28

29 Diluições seriadas Plaqueamento Métodos de incorporação em placa Sinônimos: Plaqueamento por profundidade Plaqueamento pour plate Método de espalhamento em placa Sinônimos: Plaqueamento em superfície Plaqueamento Spread-plate 29

30 Filtração Aplicado quando o numero de bactérias são muito pequenos (lagos e correntes de água). 30

31 Numero mais provável (NMP) Principio estatístico: quanto maior o numero de bactérias em uma amostra, maior será o numero de diluições necessárias para reduzir a densidade ate um ponto no qual mais nenhuma bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada. O MNP fornece somente uma estimativa de 95% de probabilidade de a população bacteriana estar em uma faixa determinada e que o MNP obtido e estatisticamente o numero mais provável. 31

32 Contagem microscópica direta Técnica: Um volume conhecido de uma suspensão bacteriana e colocado em uma área definida da lâmina microscópica. Uma lamina especialmente desenvolvida chamada de contador de células Petroff-Hausser 0,01 ml (10 µl) é adicionado na lâmina Adição de corante Observação em microscópio (lente objetiva de 100x) Contagem de diferentes regiões da lâmina, Calcular média de bactérias por campo observado Calculo do número de bactérias no centímetro quadrado MÉDIA DE BACT./ CAMPO x 100 (correção do inoculo 0,01 ml) 32

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34 Enumeração Indireto 11/20/2017 Turbidimetria Atividade metabólica Peso Seco Turbidimetria Uma maneira de monitorar o crescimento bacteriano. A medida que as bactérias se multiplicam em um meio liquido, o meio se torna turvo ou opaco com as células. O instrumento utilizado para medir a turbidez é um espectrofotômetro (ou calorímetro). No espectrofotômetro, um feixe de luz passa através de uma suspensão de bactérias ate um detector fotossensível. Com o aumento do numero de bactérias, menos luz atingira o detector. Essa alteração da luz será registrada na escala do instrumento como porcentagem de transmissão. Também será registrada a expressão logarítmica chamada de absorbância (algumas vezes denominada densidade ótica, ou DO) 34

35 Atividade metabólica Esse método assume que a quantidade de um produto metabólico determinado, como um acido ou CO2, e diretamente proporcional ao numero de bactérias presentes. 35

36 Peso Seco Uma das melhores maneiras de medir o crescimento de organismos filamentosos e pelo peso seco. Procedimento: 1. Remoção do meio de crescimento 2. Filtragem (remoção de outros materiais) 3. Dissecação 4. Pesagem Obrigada pela atenção! Juliana Moraes 36