Prof. Márcia G. Perdoncini Microbiologia Fatores de Crescimento Microbiano

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1 Fatores de Crescimento Microbiano Fatores de Crescimento Microbiano Fatores Intrínsecos e Extrínsecos

2 Fatores intrínsecos: características próprias dos alimentos Fatores extrínsecos: relacionado com o ambiente que o alimento se encontra.

3 Fatores intrínsecos: 1. Atividade de água 2. ph 3. Potencial de oxi-redução 4. Nutrientes 5. Constituintes antimicrobianos 6. Interação entre microrganismos Prof. Márcia G. Perdoncini

4 Fatores extrínsecos: 1. Temperatura 2. Umidade relativa do ambiente 3. Atmosfera gasosa (tensão de oxigênio)

5 1) Fatores intrínsecos Prof. Márcia G. Perdoncini

6 1.1) Atividade de água (Aw): Prof. Márcia G. Perdoncini A água é essencial para o metabolismo Entretanto, não basta que esteja apenas presente, mais que esteja de forma disponível. O parâmetro que mede a atividade de água em um alimento denomina-se atividade de água (Aa ou Aw) Defini-se atividade de água de um alimento ou de uma solução qualquer, como sendo a relação existente entre a pressão parcial de vapor de água contida na solução ou no alimento (P) e a pressão parcial de vapor de água pura (Po), a uma temperatura: Aa = P/Po É a água disponível, no meio ou no alimento, a qual será utilizada pelos microrganismos realizarem suas reações celulares.

7 As concentrações de solutos, adição de sais, de açúcar e de outras substâncias provoca a redução do valor de Aa em um alimento, por reduzir seu P, desse modo podem impedir que os microrganismos utilizem a água livre para o seu desenvolvimento Ex. uma solução rica em açúcar ou cloreto de sódio A redução também pode se dar através da remoção de água por desidratação ou pelo congelamento.

8 Os Microrganismos Osmofílicos são capazes de se multiplicarem em altas concentrações de açúcar; Os Microrganismos Osmodúricos,, são capazes de suportar altas concentrações de açúcar, porém não de se multiplicar. Os Microrganismos Halofílicos e Halodúricos são capazes de se multiplicar ou de suportar altas concentrações de NaCl, respectivamente De um modo geral, as bactérias necessitam de mais água livre do que as leveduras, e estas mais do que os fungos filamentosos

9 Aa varia de 0,0 a 1,00 Bactérias: 0,90 Fungos: 0,70 a 0,80 Quanto à atividade de água em que crescem, os microrganismos se dividem em: Xerófitos Mesófitos Hidrófitos Grupo de microrganismos Maioria das bactérias 0,91 Maioria das leveduras 0,88 Maioria dos mofos 0,80 Bactérias halofílicas 0,75 Fungos xerofílicos 0,65 Leveduras osmofílicas Valor mínimo de Aa 0,60 Prof. Márcia G. Perdoncini

10 1.2) ph (potencial hidrogeniônico) Prof. Márcia G. Perdoncini Cada espécie de MO possui um ph ótimo para crescer O ph intracelular deve ser sempre mantido em torno de 7,5 para crescer bem em ácido ou básico As bactérias crescem numa variação de ph de 4 a 9 Ex. Bacillus ph 11 a ph bem mais baixos Thiobacillus ph 0,5 Os bolores e as leveduras vivem em faixas mais amplas de ph do que as bactérias O picles e o chucrute são preservados por ácidos orgânicos vindos da fermentação bacteriana

11 Importante: Prof. Márcia G. Perdoncini Quando um microrganismo se desenvolve num meio de cultura, ocorre uma modificação do ph do meio devido às substâncias liberadas por seu metabolismo (substâncias de excreção do microrganismo). Esta modificação do ph no meio de cultura pode inibir o crescimento da própria bactéria. Para se evitar esta modificação do ph utiliza- se no meio de cultura uma solução tampão (a qual mantém o ph do meio de cultura sempre constante).

12 O ph é um fator de grande importância na limitação dos tipos de microrganismos capazes de se desenvolver nos alimentos. Em função destes parâmetros os alimentos podem ser classificados em: Alimentos pouco ácidos: os que possuem ph superior a 4,5. Ex: leite, carnes, pescados, alguns vegetais, etc Alimentos ácidos: os que possuem ph entre 4,5 a 4,0. Ex: algumas frutas e hortaliças. Alimentos muito ácidos: os que possuem ph inferior a 4,0. Ex: frutas cítricas, refrigerantes, maçãs, azeitonas, etc.

13 O ph 4,5 é muito importante em microbiologia de alimentos, pois assinala o nível abaixo do qual não há o desenvolvimento de Clostridium botulinum, bem como de modo geral, das bactérias patogênicas. A microflora de alimentos pouco ácidos (ph >4,5) é muito variada, havendo condições para o desenvolvimento da maioria das bactérias, fungos filamentosos e leveduras. Em alimentos ácidos (ph entre 4,5 e 4,0),, as bactérias que podem se desenvolver são as láticas e algumas esporuladas dos gêneros Bacillus e Clostridium. Nesta faixa os fungos filamentosos e as leveduras encontram boas condições para seu desenvolvimento. Nos alimentos muito ácidos (ph <4,0) podem se desenvolver apenas fungos filamentosos e leveduras e por vezes bactérias láticas e acéticas.

14 1.3) Potencial de oxi-redução: Prof. Márcia G. Perdoncini Os processos de oxidação e redução estão relacionados com a troca de elétrons entre compostos químicos. O potencial de oxi-redução pode ser definido como sendo a facilidade com que determinado substrato ganha ou perde elétrons. Quando um elemento perde elétrons, ele é dito oxidado, e quando ele ganha elétrons, reduzido. Quando ocorre a transferência de elétrons de um composto para outro, estabelece-se se uma diferença de potencial entre os mesmos. Quanto mais oxidado é um composto, mais positivo é seu potencial de oxi-redução, e quanto mais reduzido é um composto, mais negativo é esse potencial. O potencial de oxi-redução de um sistema é expresso pelo símbolo Eh

15 Microrganismos aeróbios requerem valores de Eh positivos para multiplicação (bolores, leveduras e muitas bactérias como Pseudomonas, Moraxella, Acetobacter,, etc) Os anaeróbios requerem valores baixos de Eh (bactérias patogênicas como, Clostridium botulinum) A determinação do valor de Eh de um alimento é bastante difícil porque ocorre a interação da tensão do oxigênio que envolve o alimento com a presença de compostos químicos que agem sobre o valor de Eh.

16 1.4) Nutrientes Prof. Márcia G. Perdoncini Para que a multiplicação bacteriana seja possível, os seguintes nutrientes devem estar disponíveis: água, fonte de energia, fonte de nitrogênio, vitaminas e sais minerais. Os microrganismos variam quanto suas exigências aos fatores de crescimento e a capacidade de utilizarem diferentes substratos que compõem os alimentos.

17 Principais elementos químicos para o crescimento das células: Carbono, nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. MO heterotróficos: : utilizam compostos orgânicos como principal fonte de carbono; MO autotróficos: : Utilizam CO 2 como principal ou única fonte de carbono;

18 a) Fonte de carbono: pode muitas vezes limitar o crescimento dos microrganismos. Carbono: : Forma o esqueleto das 3 maiores classes de nutrientes orgânicos: carboidratos, lipídeos e proteínas Os carboidratos complexos (polissacarídeos), tais como amido e celulose são diretamente utilizados por um número restrito de microrganismos. Os fungos filamentosos (Bolores) são de particular interesse na deterioração de alimentos que contenham estes substratos, por haver muitas espécies produtoras de enzimas celulolíticas e amilolíticas.

19 As gorduras e os óleos são atacados por microrganismos lipolíticos como por exemplo, muitos fungos filamentosos, leveduras e bactérias (Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes e outros); Porém, grande número de microrganismos não tem a capacidade de crescerem nesses substratos Microrganismos com atividade pectinolítica provocam a quebra da pectina dos vegetais.

20 b) Fonte de nitrogênio: Prof. Márcia G. Perdoncini Nitrogênio: : é essencial para formar os aminoácidos e conseqüentemente as proteínas Fontes: Compostos nitrogenados como nitritos, nitratos, sais de amônia ou nitrogênio orgânico (aminoácidos, peptídeos) A fonte de nitrogênio não é tão importante quanto a de carbono na limitação do desenvolvimento microbiano. Microrganismos proteolíticos (aqueles que possuem enzimas que degradam proteínas) são importantes em alimentos ricos em proteínas, onde provocam alterações no odor e no sabor.

21 c) Fonte de vitaminas: Em geral os alimentos possuem as quantidades necessárias para o crescimento dos microrganismos. As bactérias Gram-positivas são as mais exigentes de vitaminas do complexo B As Gram-negativas e os fungos geralmente são capazes de sintetizar todas as vitaminas que necessitam.

22 d) Sais minerais: Não são limitantes ao desenvolvimento microbiano. e) Enxofre: Biossíntese dos aminoácidos: cistina, cisteína e metionina f) Fósforo: Síntese de ácidos nucléicos e ATP; Íons inorgânicos: Sulfato e fosfato podem suprir também elementos necessários para os microrganismos;

23 g) Outros elementos: Prof. Márcia G. Perdoncini Íon sódio: : Transporta o açúcar melibiose pela permease Ferro: : necessário para o funcionamento das enzimas citocromo, catalase, succinil desidrogenase; Cloreto de Sódio (NaCl) : bactérias halofílicas gostam de sal Elementos minerais: : zinco, cobre, manganês, molibdênio e cobalto. São elementos traços,, geralmente utilizados em funções enzimáticas. Podem ser adicionados ao meio de cultura ou são encontrados como impurezas de outros elementos no meio como impurezas de outros elementos no meio de cultura.

24 Classificação nutricional dos microrganismos: Prof. Márcia G. Perdoncini 1. Microrganismos Quimiotróficos: : utilizam compostos químicos para obter energia 1.1) Microrganismos Quimioautotróficos: Fonte de energia: compostos inorgânicos Fonte de carbono: CO 2 1.2) Microrganismos Quimioheterotróficos: Fonte de energia: compostos orgânicos Fonte de carbono: compostos orgânicos 2. Microrganismos Fototróficos: : dependem de luz para produzir energia

25 1.5) Constituintes Antimicrobianos: Prof. Márcia G. Perdoncini A estabilidade de alguns produtos, de origem animal e vegetal, ocorre na natureza devido a presença de substâncias antimicrobianas, tendo a capacidade de retardar ou mesmo de impedir a multiplicação microbiana. Alguns exemplos são as amoras, que possuem o ácido benzóico; cravos, que tem óleos essenciais e a canela, que contém aldeído cinâmico. Os condimentos contém vários óleos essenciais com atividade antimicrobiana, tais como o eugenol do cravo, alicina no alho, aldeído cinâmico e eugenol na canela, alil-isotiocianatoisotiocianato na mostarda, timol e isotimol no orégano

26 1.6) Interação entre microrganismos: Prof. Márcia G. Perdoncini Um determinado microrganismo, ao se multiplicar em um alimento, produz metabólitos que podem afetar a capacidade de sobrevivência e de multiplicação de outros microrganismos presentes nesse alimento. Assim, por exemplo, as bactérias produtoras de ácido lático podem alterar o ph do alimento de tal forma que torna ácido demais para o crescimento de muitos outros microrganismos. Muitos microrganismos são capazes de produzir determinadas substâncias com atividade bactericida, denominadas genericamente de bacteriocinas. O maior interesse na área de alimentos é pelas bactérias láticas, capazes de produzir uma ou mais bacteriocinas. Algumas bacteriocinas são proteínas simples, outras tem componentes lipídicos e açúcares.

27 2) Fatores extrínsecos: 2.1) Temperatura 2.2) Umidade relativa do ambiente 2.3) Atmosfera gasosa (tensão de oxigênio)

28 2.1) TEMPERATURA: Prof. Márcia G. Perdoncini Todas as reações que ocorrem nos microrganismos são dependentes de temperatura Os microrganismos são capazes de serem encontrados em ampla faixa de temperatura (de -20 o C a + 90 o C), devido a alta capacidade de adaptação que possuem Os MO podem crescer em temperaturas variadas Ex. Bacillus subtilis ( 8 o C 35 o C ) Neisseria gonorrhoea ( 30 o C 40 o C ) As reações são catalisadas por enzimas

29 Todo o microrganismo tem uma temperatura ótima de crescimento e uma faixa de crescimento. Em temperaturas abaixo da faixa de crescimento, não há multiplicação. Em temperaturas superiores, pode haver redução, caso a temperatura seja letal à célula. Na temperatura ótima de crescimento: : é a temperatura na qual uma espécie de MO cresce mais rapidamente. O tempo de geração é o menor possível, havendo uma rápida multiplicação. Temperatura mínima: : é a menor temperatura onde ainda há crescimento Temperatura máxima: é a maior temperatura onde ainda há crescimento Quanto mais a temperatura se afasta do ótimo, porém dentro da faixa de crescimento, maior é o tempo de geração, ficando portanto mais lenta a multiplicação.

30 Obs.. A temperatura ótima é próxima da temperatura máxima, devido às enzimas ter suas reações mais rápidas pelo aumento de temperatura, até um ponto em que elas são danificadas pelo calor e as células param de crescer. Os MO podem ser divididos em 3 grupos, de acordo com a variação de temperatura na qual crescem melhor: Psicrófilos: quando se multiplicam em temperaturas de refrigeração, com temperatura ótima entre 12 e 20 o C. Psicrotróficos: quando se multiplicam em temperaturas de refrigeração, tendo o ótimo para crescimento entre 20 o C e 30 o C. Mesófilos: Quando se multiplicam bem em temperatura entre 30 e 45 o C. Crescem melhor em temperaturas moderadas Termófilos: : Quando se multiplicam em T acima de 45 o C, tendo um ótimo entre 45 o C e 55 o C. Os termodúricos não se multiplicam, porém suportam temperaturas elevadas.

31 2.1.1) MICRORGANISMOS PSICRÓFILOS: Prof. Márcia G. Perdoncini Temperatura: : 12 o C a 20 o C ou mais baixas Em temperaturas de 4 o C a 10 o C os MO psicrófilos deterioram alimentos estocado por períodos prolongados Ex. de bactérias psicrófilas: Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes

32 2.1.2) MICRORGANISMOS PSICROTRÓFICOS: Quando se multiplicam em temperaturas de refrigeração, Temperatura ótima para crescimento entre 20 o C e 30 o C.

33 2.1.3) MICRORGANISMOS MESÓFILOS: A maioria dos MO são mesófilos Temperatura entre 30 o C a 45 o C 25 o C: são saprófitas (não patogênicos) 37 o C: patogênicos ao homem (febre pode inibir o crescimento destes MO)

34 2.1.4) MICRORGANISMOS TERMÓFILOS: Temperaturas entre 45 o C e 85 o C (T. Ótima 50 o C 60 o C)

35 2.2) Umidade relativa do ambiente: Há uma correlação estreita entre a atividade de água (Aa) de um alimento e a umidade relativa de equilíbrio do ambiente. Quando o alimento está em equilíbrio com a atmosfera, a umidade relativa (UR) é igual a Aa X 100. Assim, alimentos conservados em ambiente com UR superior à sua Aa tenderão a absorver umidade do ambiente, causando um aumento em sua Aa. Por outro lado, os alimentos perderão água se a umidade ambiental for inferior à sua Aa, causando uma diminuição nesse valor.

36 2.3) ATMOSFERA GASOSA (Tensão de oxigênio): Os principais gases que afetam o crescimento dos MO são: Oxigênio, gás carbônico, nitrogênio e metano O gás carbônico é utilizado por todos os MO. O oxigênio é utilizado por alguns MO sendo tóxico para outros

37 Com relação a tensão de oxigênio necessária ao desenvolvimento, os microrganismos podem ser classificados em: I. Aeróbios: quando só desenvolvem na presença de oxigênio (ar atmosférico) II. Anaeróbios Obrigatórios: quando só se desenvolvem na ausência de oxigênio III. Facultativos (Anaeróbios Facultativos): quando se desenvolvem tanto na presença como na ausência do oxigênio. IV. Microaerófilos: necessitam de pequenas quantidades de oxigênio

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39 2.3.1) MICRORGANISMOS AERÓBIOS: Necessitam de 21 % de oxigênio ex. fungos filamentosos Crescem nas superfícies de meios sólidos Em meios líquidos deve haver aeração, que se consegue através da agitação dos tubos

40 2.3.2) MICRORGANISMOS FACULTATIVOS ou Anaeróbios Facultativos: Cresce em presença de O 2 ou em ambiente de anaerobiose Em ambiente de anaerobiose eles realizam a fermentação Ex. bactérias da família Enterobacteriaceae (ex. Escherichia coli ),, leveduras (Saccharomyces cerevisie)

41 2.3.3) MICRORGANISMOS ANAERÓBIOS Podem ser mortos na presença de oxigênio Não crescem na presença de oxigênio Anaeróbios estritos: : são mortos a uma breve exposição ao ar

42 Mecanismo de toxicidade do O 2 à célula bacteriana anaeróbia: Quando o O 2 entra em contato com estas células, este provoca reações que libera radicais superóxido (radicais livres) que causam danos as células e também formam os radicais OH. Os radicais OH. são altamente reativos (vivem <1/ segundos), e danificam quase todas as moléculas da célula, inclusive o DNA.

43 Alguns MO desenvolvem um MECANISMO DE DEFESA contra o ataque do O 2 : Produzindo enzimas que eliminam os radicais. Estas enzimas são: A superóxido dismutase,, que elimina os radicais superóxido (que converte os radicais superóxido em peróxido de hidrogênio); A catalase que converte o H 2 O 2 em O 2 e H 2 O A peroxidase: : que converte o H 2 O 2 em H 2 O Portanto este mecanismo de defesa não deixa os radicais OH. e superóxido serem formados,, com isto as moléculas da célula não são destruídas. Para cultivar MO anaeróbios é necessário uma câmara de anaerobiose ou glove box (qualquer oxigênio presente na câmara é removido numa reação com o H 2 )

44 glove box câmara de anaerobiose

45 2.3.4) MICRORGANISMOS MICROAERÓFILOS: Crescem em níveis baixos de oxigênio (1 a 15%) Não toleram 21 % de oxigênio (atmosfera) A tolerância ao O 2 é baixa devido a alta susceptibilidade aos radicais peróxidos Ex. Campylobacter jejuni

46 Ref. Bibliográficas: PELCZAR,M. conceitos e aplicações, Vol 1, São Paulo: Makrons Books, LANDGRAF, Mariza. dos alimentos, São Paulo: Atheneu, ROITMANN, T,. Tratado de, São Paulo, Manole, 1987.