APÊNDICE A: CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DA FLORA DO

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1 Apêndice A APÊNDICE A: CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DA FLORA DO IOGURTE Material Iogurte Meio de cultura Solução de diluição Reagentes Equipamento Iogurte comercial L-S Differencial Medium [L-S (DM)] Água de peptona Violeta de cristal Solução de lugol Safranina Cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazolio (TTC) Álcool a 95º Fósforos Ansa de inoculação Bico de Bunsen Esguicho com álcool a 70º Esguicho com água destilada Papel absorvente Marcador Caixas de Petri Tubos de ensaio e respectivo suporte Erlenmeyer Vareta de vidro Pipetas de 1 ml esterilizadas Estufa Banho-maria Vórtex Microscópio, lâminas, lamelas e óleo de imersão Preparação e execução do ensaio Preparação da solução de diluição e do meio de cultura A solução de diluição a utilizar é a água de peptona cuja composição e modo de preparação são a seguir descritos: Solução de diluição Composição Peptona trípsica de caseína Peptona pépsica de carne Água destilada 0.05 g 0.05 g 100 ml i

2 Apêndice A Preparação Dissolver os componentes, em água destilada, aquecendo até à ebulição, se necessário. Verter 9 ml de solução de diluição por tubo de ensaio. Preparar um dos tubos com algumas contas de vidro. Autoclavar a 121º C durante 15 minutos. O meio de cultura a utilizar é o L-S Differencial Medium da Oxoid que designar-se-á por L-S (DM). Apresenta-se em seguida a sua composição e modo de preparação. Meio de cultura L-S (DM) A. Meio base Composição Triptona 1.0g Pó de Lab-Lemco 0.5g Peptona de Soja 0.5g Extracto de Levedura 0.5g Dextrose 2.0g Cloreto de Sódio 0.5g Cloridrato de L-cisteína HCl 0.03g Agar 1.3g Água destilada 100 ml Preparação Dissolver os componentes, em água destilada, aquecendo até à ebulição. Ajustar, se necessário, o ph de modo a que depois da esterilização seja 6.1±0.1 a 25 ºC. Verter 9 ml de meio por tubo de ensaio. Autoclavar a 121º C durante 15 minutos. Arrefecer os tubos de ensaio, com o meio base, em banho-maria até os 50 ºC. B. Preparar um tubo de ensaio com 20 ml de leite magro a 10%, isento de antibióticos e/ou outros inibidores. Autoclavar a 115 ºC durante 15 minutos: Manter o tubo de ensaio a 50 ºC no banho-maria. C. Preparar um tubo de ensaio com uma solução de cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazolio (TTC) a 2%. Esterilizar por filtração. Manter o tubo de ensaio a 50 ºC no banho-maria. ii

3 Apêndice A D. Meio de cultura final Adicionar a cada tubo de ensaio contendo o meio base (já preparado) 1 ml de leite e 100 µl de solução TTC a 2%. Manter o tubo de ensaio a 50 ºC. NOTA: Todas as operações abaixo indicadas têm de ser executadas junto à chama de um bico de Bunsen com os cuidados normais de assepsia. Preparação da amostra Homogeneizar bem um iogurte natural com a ajuda de uma vareta de vidro esterilizada à chama. Retirar 1.0 ml do iogurte e juntar a um tubo de ensaio com 9.0 ml de água de peptona com contas de vidro (a suspensão deve ser agitada no vórtex por forma a obter uma suspensão uniforme). Preparação das diluições da amostra Após obter uma suspensão uniforme e porque esta possui com toda a certeza um elevado número de bactérias, é necessário diluir a amostra inicial. Fazer diluições decimais que se representarão pelos respectivos algoritmos (-1 = 1/10 = 0.1; -2 = 1/100 = 0.01;...-9) Para preparar uma diluição decimal pipeta-se uma unidade da diluição anterior ajustando a dez unidades Exemplo: Preparação de uma diluição1/1000 [-3] - 1º passo diluição 1/10 [-1]: adicionar 1.0 ml da solução mãe a 9.0 ml de solução de diluição. - 2º passo diluição 1/100 [-2]: adicionar 1.0 ml da solução 1/10 a 9.0 ml de solução de diluição. - 3º passo diluição 1/1000 [-3]: adicionar 1.0 ml da solução 1/100 a 9.0 ml de solução de diluição. Marcar os tubos de ensaio, contendo a solução de diluição, com o logaritmo das diluições pretendidas (-1 a -9). Preparar as diluições da amostra como se exemplificou acima. Sementeira por incorporação Juntar 1.0 ml da diluição -5 à solução de diluição de um dos tubos de ensaio com o meio. Agitar vigorosamente o tubo com ajuda do vórtex. Verter, assepticamente, o conteúdo deste tubo para dentro de uma caixa de petri esterilizada. iii

4 Apêndice A Repetir o procedimento atrás para cada diluição duas vezes. Marcar as caixas de Petri. Repetir os passos anteriores para as diluições -6, -7, -8 e -9. Proceder à incubação em estufa a 37 ºC durante 48 h. As caixas de Petri devem ficar em posição invertida. Observação dos resultados Observar as caixas de Petri. Seleccionar algumas colónias (as mais isoladas), fazer a coloração de Gram, que se encontra imediatamente descrita, e observar ao microscópio. Coloração de Gram Corar o esfregaço preparado com uma gota de violeta de cristal. Agitar suavemente durante cerca de 60 segundos. Lavar com água corrente (a água deve começar a correr numa extremidade da lâmina e passar por cima do esfregaço). Inundar com soluto de Lugol. Agitar suavemente durante cerca de 60 segundos. Lavar com água corrente. Secar suavemente com papel de filtro. Descorar com álcool etílico da farmácia a 96 %. Agitar suavemente durante cerca de 30 segundos. Secar suavemente com papel de filtro. Corar com solução de safranina 0,25 %. Agitar suavemente durante cerca de 30 segundos. Lavar com água corrente. Secar suavemente com papel de filtro. Observar ao microscópio com a objectiva de imersão (100 x). O álcool etílico nas Gram negativas remove os lípidos da membrana externa da parede celular, aumentando a sua permeabilidade; assim, o complexo violeta de cristal-iodo no interior das células pode ser extraído por descoloração, ficando estas bactérias coradas de vermelho (safranina). As bactérias Gram positivas, por terem baixo teor lipídico não são afectadas; pelo contrário, são desidratadas pelo álcool, o que leva à redução da permeabilidade e coloração do complexo violeta de cristal-iodo. iv

5 Apêndice B APÊNDICE B: PREPARAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA E DO TAMPÃO PBS PREPARAÇÃO DO MEIO LÍQUIDO DE CULTURA MRS (OXOID) 1. Pesar directamente num matraz 52.0 g de meio MRS broth em pó; 2. Adicionar 1 L de água destilada; 3. Colocar o matraz sobre uma placa de agitação e de aquecimento; 4. Corrigir o ph para 6.1±0.2; 5. Deixar levantar fervura e autoclavar a 121 C durante 15 minutos. PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÃO DO MEIO LÍQUIDO DE CULTURA YEPD Um dos meios utilizados para crescer S. cerevisiae consiste na composição: Peptona 20.0 g Extracto de levedura 10.0 g Glucose 20.0 g Água destilada ml 1. Pesar cada um dos reagentes em separado; 2. Adicionar 1 L de água destilada; 3. Colocar o matraz sobre uma placa de agitação e de aquecimento; 4. Corrigir o ph para 7.0±0.2; 5. Deixar levantar fervura e autoclavar a 121 C durante 15 minutos. NOTA: Para preparar os meios MRS e YEPD sólidos procede-se do mesmo modo, depois de adicionar uma concentração de 14 g/l de agar. PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÃO DO TAMPÃO PBS A PH = 7,2 O tampão PBS com ph =7,2 pode ser preparado com a composição: Di Hidrogenofosfato de potássio (KH 2 PO 4 ) 0.34 g Hidrogenofosfato de di-potássio (K 2 HPO 4 ) 1.21 g Cloreto de sódio (NaCl) 8.00 g Água destilada ml 1. Pesar cada um dos reagentes em separado; 2. Adicionar 1 L de água destilada; v

6 Apêndice C APÊNDICE C: TÉCNICAS DE MICROBIOLOGIA CULTIVO DE CÉLULAS LIOFILIZADAS CONGELAMENTO D 1. Ampola que contém cultura de interesse liofilizada. 2. Usar luvas de protecção! Aquecer a extremidade da ampola. 3. Colocar duas ou três gotas de água na extremidade quente para partir o vidro. 4. Cuidadosamente retirar a extremidade de vidro. 5. Deixar entrar um pouco de ar e depois remover o algodão. 6. Introduzir aproximadamente 0,5 ml de meio adequado e misturar bem. 7. Transferir o volume da mistura para o meio líquido ou sólido adequado. Permitir uma rehidratação lenta da cultura. 8. Incubar a cultura nas condições óptimas de crescimento. 9. Antes de deixar fora, esterilizar a ampola. CONGELAMENTO DE CULTURAS Esterilizar eppendorfs, pontas azuis, glicerol e meio de cultura. À chama juntar 1 ml de cultura overnight com 300 µl de glicerol. Colocar em gelo durante 10 minutos. Congelar a 80 ºC. DESCONGELAMENTO DE CULTURAS Retirar da arca a 80 ºC. Pôr em congelador a 20 ºC algumas horas. Colocar à temperatura ambiente. Inocular em meio adequado vi

7 Apêndice D APÊNDICE D: DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR PELO MÉTODO DA CONTAGEM POR TURBIDIMETRIA O método da contagem por turbidimetria baseia-se na lei de Lambert-Beer. Esta lei mostra que, quando um feixe de luz incidente atravessa uma suspensão de microrganismos, sofre uma diminuição de intensidade proporcional, dentro de certos limites, à concentração de células em suspensão. A lei assume o aspecto final: A = K.C em que A é a absorvência da suspensão e C a sua concentração celular. A linearidade da equação, devida à constante K, só ocorre para valores de absorvência inferiores a 0,70, onde a reflexão e a dispersão da luz pela suspensão são fenómenos pouco importantes. Ou seja, a quantidade de luz que atinge o detector é apenas afectada pela absorção da luz incidente por parte da suspensão celular. Procedimento experimental: Montar o sistema de filtração. Pesar 5 membranas estéreis. Retirar três amostras de 5 ml e uma de 10 ml da suspensão celular. Filtrar individualmente as três amostras de 5 ml, lavando a biomassa retida no filtro com 15 ml de água destilada. Preparar o branco em duplicado, filtrando 20 ml de água destilada por cada membrana. Colocar as membranas sobre uma folha de alumínio, dentro de placas de Petri e proceder à secagem numa estufa a 80 º C durante toda a noite. Com a amostra de 10 ml, fazer a leitura preliminar no espectrofotómetro e fazer as diluições de modo a possibilitar a construção de uma curva padrão (densidades ópticas a 620 nm entre 0,2 e 0,8). Medir a absorvência. Pesar as membranas depois de as deixar arrefecer num exsicador para evitar adsorção de vapor de água. Descontar o peso médio dos controlos. Calcular o peso seco (g/l) das diluições, com base no valor obtido para a amostra. Construir uma curva padrão tendo em abcissas os valores de absorvência e em ordenadas o peso seco em g/l. Retirar uma amostra da suspensão celular a analisar, proceder às diluições necessárias e ler a absorvência a 620 nm. Com auxílio da curva padrão, determinar a concentração celular. De acordo com este procedimento as curvas obtidas para os bacilos e leveduras foram, no espectrofotómetro JASCO, respectivamente: Conc. bacilos ( g/l) = DO(620 nm) R 2 = Conc. leveduras (g/l) = DO(620 nm) R 2 = vii

8 Apêndice E APÊNDICE E: EXEMPLIFICAÇÃO DE CÁLCULOS PARTE I CONVERSÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS OBSERVADAS NA CÂMARA DE NEUBAUER PARA CONCENTRAÇÃO (N º CÉLULAS/ML) A câmara de Neubauer consiste numa lâmina de microscopia, bem mais alta do que uma lâmina normal, com marcações em quadrantes, de medidas conhecidas. Observando-se ao microscópio, percebe-se que existem três tipos de quadrantes denominados A, B e C, que juntos formam um quadrado maior. Figura E.1. Retículos da câmara de Neubauer A área total compreendida pelos 9 quadrantes é de 9 mm 2 sendo que cada quadrante (A, B e C) são quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a lamela a distância desta até a lâmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obter um volume de 0,1 mm 3 em cada quadrante. O quadrante C divide-se em 25 sub-quadrantes com 0,2 mm de lado. As células são contadas nos quatro cantos (quadrados c) e no sub-quadrante central. Esses quadrados mais pequenos encontram-se ainda divididos em 16 quadradinhos de 0,05 mm de lado. O volume de cada um dos quadrados c é 0,2 0,2 0,1 mm 3 = 0,004 mm 3 = cm 3. Nas tabelas apresentadas na secção Apêndice F: Observações Experimentais estes sub-quadrantes c vêm designados por H1,H2,H3,H4 e H5. A determinação do número de microrganismos por volume pode ser calculado fazendo: n nº medio. de. células. nos. diferentes. quadrados. c 4 10 º microrganismos / ml = 6 Tomando como exemplo o ensaio A da parte I, para 1 ml de volume recolhido, no caso dos bacilos vem n º células / ml = 6 5 = bacilos/ ml viii

9 Apêndice E PARTE II CONVERSÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS OBSERVADAS EM LÂMINA SIMPLES PARA CONCENTRAÇÃO (N º CÉLULAS/ML) A forma mais correcta de determinar a concentração de microrganismos numa amostra, em termos de número de células por volume, implica captarem-se várias imagens (normalmente vinte e cinco) em diferentes pontos da lamela. Para evitar repetir a contagem de uma mesma célula, e o valor de concentração estimado ser mais plausível, procede-se, em geral, como está ilustrado na Figura E.2., isto é, as fotografias são tiradas ao longo de uma trajectória, previamente, determinada. Figura E.2. Esquema da lâmina com os percursos a seguir na lamela para determinação da concentração de microrganismos de uma amostra. Em seguida procede-se à contagem das células em estudo, para cada uma das imagens captadas, e calcula-se o respectivo valor médio. A partir daqui são extremamente importantes as características do microscópio e do programa de aquisição de imagem. O programa de aquisição de imagem empregado foi o programa Axioskop. Este programa indica, para a ampliação correspondente, a relação que existe entre micrómetros e pixeis. Com o valor da resolução da imagem, calcula-se a área da fotografia em termos de pixeis. De forma mais clara, nos ensaios realizados utilizou-se uma ampliação que verificava a relação de 0, micrómetros/pixeis para o eixo X e Y. Uma vez que a resolução era de 1300 (eixo X) 1030 (eixo Y) micrómetros, determinou-se o valor da área de cada fotografia, sendo este de 93382,70 pixeis. Com o valor médio de células por fotografia e a sua área, pode determinar-se a concentração: nº células nº medio. de. células. nas. fotografias Conc. células = 2 2 µ m Área. de. cada. fotografia( µ m ) No caso do ensaio A da parte II para os bacilos, por exemplo, vem: 12,19231 bacilos Conc. bacilos = = 0, ,70 µ m O valor encontrado corresponde à concentração de células numa fotografia. Este valor de concentração pode ser alargado à lamela, dado que é conhecida a área das lamelas utilizadas mm. Vem então, seguindo o mesmo exemplo: ix

10 Apêndice E 2 ( ) nº bacilos nº bacilos Conc. bacilos = Conc. bacilos Área. da. lamela mm 2 lamela mm bacilos Conc. bacilos = 130, = lamela Conhecendo o volume de amostra que se deita na lâmina (15 µl), e partindo do princípio de que a gota fica uniformemente espalhada pela lamela, calcula-se o valor da concentração de células na lamela em termos de número de células por volume. Ainda com o mesmo exemplo: nº bacilos Conc. bacilos nº bacilos lamela Conc. bacilos = µ L Volume. ( µ L) bacilos Conc. bacilos = µ L Uma vez que neste trabalho é atribuída uma grande importância à forma das células, era necessário, além de observá-las ao microscópio e saber se estavam ou não aglomeradas, conhecer as suas dimensões. Esse conhecimento, depois de avaliar os programas de tratamento de imagem disponíveis, foi auxiliado pelo programa Sigma Scan Pro 5, que tem-se mostrado satisfatório, sobretudo, na contagem de objectos. Em seguida exemplifica-se como o programa permite a determinação do tamanho de bacilos. Figura E.3. Fotografia de L.bulgaricus captada com uma ampliação de DIC no microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB, a ser tratada pelo Sigma Scan Pro 5, inicialmente. x

11 Apêndice E Figura E.4.Fotografia de L.bulgaricus captada com uma ampliação de DIC no microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB, e modificada pelo Sigma Scan Pro 5 com base na diferença de cor. Figura E.5. Fotografia de L.bulgaricus captada com uma ampliação de DIC no microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB, modificada pelo Sigma Scan Pro 5 e a ser optimizada para a contagem dos objectos e determinação das suas dimensões. xi

12 Apêndice E Figura E.6. Fotografia de L.bulgaricus captada com uma ampliação de DIC no microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB, modificada pelo Sigma Scan Pro 5 e a serem definidos os parâmetros de interesse para avaliação das suas dimensões. Figura E.7. Fotografia de L.bulgaricus captada com uma ampliação de DIC no microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB, modificada pelo Sigma Scan Pro 5 e com o número de objectos contados e com a área, comprimento e altura de cada um dos objectos numa folha de cálculo Excel. xii

13 Apêndice E Foi a partir da folha de Excel e a observar cada um dos objectos contados nas imagens modificadas pelo Sigma Scan Pro 5, tentando desprezar resíduos e lixos, que se elaboraram as tabelas de distribuição de tamanhos e histogramas apresentados no Apêndice F Observações Experimentais. Ao iniciar a contagem das diferentes células, depois de realizar um ensaio de filtração, preenchia-se uma tabela semelhante à Tabela F.16. das Observações Experimentais Parte II, e desencadeavam-se todas as tabelas seguintes. Os cálculos envolvidos são muito parecidos aos já descritos e/ou bastante óbvios pelo que não são aqui exemplificados. xiii

14 APÊNDICE F: OBSERVAÇÕES EXPERIMENTAIS PARTE I Na primeira parte do trabalho realizaram-se os ensaios A, B e C. São apresentadas, inicialmente, as condições com que se cumpriram estes ensaios. Tabela F.1 Propriedades da coluna e do leito de filtração nos ensaios A, B e C durante a parte I da investigação. Propriedades da coluna e do leito de filtração Altura do leito 16,7 cm Volume do leito 231,37 cm 3 Volume de espaços vazios 48 cm 3 Porosidade 0,217 Posição da bomba 30 Recorreu-se ao microscópio invertido do laboratório de imagem do DEB para observar as amostras na câmara de Neubauer. O microscópio invertido foi utilizado com as propriedades descritas na Tabela F.2. Tabela F.2 Características do microscópio utilizado nos ensaios A, B e C durante a parte I da investigação. Potenciómetro Objectiva Filtro acima da objectiva Condensador Polarizador Características do microscópio invertido 6 V 40x PH2,2 Todo voltado para cima Todo aberto Para avaliação das dimensões dos microrganismos utilizou-se o programa Image Pro Plus. No final de cada um destes primeiros ensaios de filtração agitava-se a amostra a analisar (enquanto as outras eram mantidas a 4ºC). Um pequeno volume desta amostra era colocado, de forma adequada, na câmara de Neubauer e observado no microscópio de luz invertida do Laboratório de Imagem do DEB. Fazia-se, então, a contagem das células, em duas leituras, anotando-se os valores para cada um dos cinco pequenos quadrados (H1, H2,...) do retículo central. Este procedimento era repetido para cada amostra, tendo-se obtido as Tabelas F.3, F.4 e F.5. O ensaio A prosseguiu com leveduras S.cerevisiae com 5,3 µm de diâmetro médio e Lactobacillus bulgaricus com 4,3 µm de comprimento médio. As concentrações iniciais das leveduras e dos bacilos, determinadas com a câmara de Neubauer, foram de, respectivamente, 2, células/ml e 6,915x10 7 células/ml. xiv

15 Tabela F.3 Número de leveduras (L) e bacilos (B) observados no retículo central da câmara de Neubauer ao longo do volume recolhido, com uma ampliação de DIC no microscópio invertido, para o ensaio A da parte I. Volume (ml) Leitura Câmara de Neubauer H1 H2 H3 H4 H5 L B L B L B L B L B 1ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª xv

16 No ensaio B o diâmetro médio das leveduras era 6,1 µm e a concentração usada, determinada por contagem na câmara de Neubauer, foi de 3, células/ml. O comprimento dos bacilos era de 4,07 µm e a concentração usada foi de 4, células/ml. Tabela F.4 Número de leveduras (L) e bacilos (B) observados no retículo central da câmara de Neubauer ao longo do volume recolhido, com uma ampliação de DIC no microscópio invertido, para o ensaio B da parte I. Volume (ml) Câmara de Neubauer Leitura H1 H2 H3 H4 H5 L B L B L B L B L B 1ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª xvi

17 No ensaio C utilizaram-se S.cerevisiae com 5,6 µm de diâmetro e Lactobacillus bulgaricus com 3,73 µm de tamanho médio. Respectivamente as concentrações iniciais foram de, 2, células/ml e 5,555x10 7 células/ml. Tabela F.5 Número de leveduras (L) e bacilos (B) observados no retículo central da câmara de Neubauer ao longo do volume recolhido, com uma ampliação de DIC no microscópio invertido, para o ensaio C da parte I. Volume (ml) Câmara de Neubauer Leitura H1 H2 H3 H4 H5 L B L B L B L B L B 1ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª xvii

18 Ao esboçar o gráfico para cada uma das tabelas evidencia-se uma grande semelhança entre os ensaios B e C. Partindo deste facto, calculou-se o valor médio da concentração de cada um dos microrganismos, ao longo do volume recolhido, para os ensaios B e C. O resultado é apresentado no gráfico da Figura F Nº médio de células (ensaio B ec) /ml S.cerevisiae L.bulgaricus Figura F.1. Valor médio da concentração de S.cerevisiae e L. bulgaricus nos ensaios B e C da parte I ao longo do volume recolhido. PARTE II Na segunda parte do trabalho realizaram-se vários ensaios. Dado que em cada um estão envolvidos vários gráficos e tabelas, estes só são apresentados na totalidade para o ensaio A. Para os restantes ensaios apresentam-se apenas os gráficos finais. Tabela F.6 Propriedades da coluna e do leito de filtração no ensaio A da parte II da investigação. Propriedades da coluna e do leito de filtração Altura do leito 15,0 cm Volume do leito 207,82 cm 3 Volume de espaços vazios 43 cm 3 Porosidade 0,227 Posição da bomba 30 Tabela F.7 Características do microscópio utilizado nos ensaios da parte II da investigação. Características do microscópio Leitz Potenciómetro 6 V Filtro junto à ocular 3x Objectiva 40x Filtro abaixo a objectiva PH2,2 Condensador Todo voltado para cima Polarizador Todo aberto xviii

19 Tabela F.8 Características do programa da aquisição de imagem Axiovision 3.1 utilizado nos ensaios da parte II da investigação. Câmara Escalas Programa AxioVision exposure white balance scaling to 8 bits basic adjustment 2-scaling 1371 ms picking none RGB, 1300x1030 X 0, micrómetros/pixeis Y 0, micrómetros/pixeis Tabela F.9 Propriedades das imagens adquiridas com uma objectiva de 40 e contraste de fase pelo programa AxioVision nos ensaios da parte II da investigação. Propriedades da imagem X Y Área 1300 pixeis 1030 pixeis pixeis 2 343, micrómetros 272, micrómetros 93382,70146 micrómetros 2 As lamelas utilizadas tinham uma área de 20 mm 20 mm = 400 mm 2 xix

20 Tabela F.10 Determinação da concentração de bacilos, no início do ensaio de filtração A, da parte II da investigação. Imagem Nº células Media do nº de células Concentração (n células/µm 2 ) Concentração (n células/mm 2 ) Concentração lamela (n células/mm 2 ) Concentração lamela (n células/µl) 12,1923 1,3056 E-4 130, xx

21 Tabela F.11 Conversão do comprimento dos bacilos de pixeis para micrómetros, no ensaio A da parte II da investigação. Comprimento (pixeis) Comprimento (µm) Comprimento (pixeis) Comprimento (µm) Comprimento (pixeis) Comprimento (µm) Comprimento (pixeis) Comprimento (µm) 1 16,5529 4, ,0830 3, ,2047 4, , , ,2643 4, ,3196 7, , , ,1421 3, , , ,1803 2, ,6155 5, ,2627 4, ,5269 8, , , ,2956 2, ,5466 7, ,4164 3, ,4222 3, ,6158 2, ,6879 9, ,0238 5, , , ,2111 1, ,4018 3, , , ,2866 8, ,8403 5, ,6742 9, ,0192 6, ,1555 4, ,0238 5, , , ,5610 5, ,4853 2, ,6301 2, ,0000 3, , , ,8062 3, ,7698 6, ,9737 5, ,7648 3, ,2354 5, ,4164 3, ,4383 9, ,1725 6, ,6497 8, ,3178 3, ,7047 3, ,6010 4, ,7321 7, ,4536 3, , , ,3411 9, ,4951 6, ,7308 7, , , ,0623 2, ,4165 5, ,7099 6, ,2315 4, , , ,1725 6, ,5610 5, ,7924 7, ,5269 8, , , ,0830 3, , , ,8660 3, ,0499 2, ,5242 4, ,0333 3, ,2801 1, , , ,7082 1,7715 xxi

22 Tabela F.12 Distribuição do comprimento dos bacilos, no ensaio A da parte II da investigação. Bloco (µm) Frequência % Acumulada 1 0 0,00% 2 3 4,00% ,33% ,33% ,00% ,00% ,00% ,67% ,00% ,33% ,67% ,00% ,67% ,33% ,33% ,67% ,67% ,00% ,00% ,00% Mais 0 100,00% ,00% ,00% 12 Frequência Frequência % Acumulada 80,00% 60,00% 40,00% ,00% Mais Comprimento ( m) µ,00% Figura F.2. Distribuição do comprimento dos bacilos, frequência e percentagem acumulada, no ensaio A da parte II da investigação. xxii

23 Tabela F.13 Determinação da concentração de leveduras, no início do ensaio de filtração A, da parte II da investigação. Imagem Nº células Media do nº de células Concentração (n células/µm 2 ) Concentração (n células/mm 2 ) Concentração lamela (n células/mm 2 ) Concentração lamela (n células/µl) 6,8462 7,3313E-05 73, xxiii

24 Tabela F.14 Conversão da área das leveduras de pixeis para micrómetros, e cálculo do respectivo diâmetro no ensaio A da parte II da investigação. Área (pixeis 2 ) Área (µm 2 ) Diâmetro (µm) Área (pixeis 2 ) Área (µm 2 ) Diâmetro (µm) Área (pixeis 2 ) Área (µm 2 ) Diâmetro (µm) Área (pixeis 2 ) ,2023 4, ,7164 3, ,5758 4, ,8300 4, ,6444 4, ,2000 5, ,0450 2, ,6669 5, ,4611 3, ,1112 4, ,5533 3, ,2248 5, ,5274 4, ,7401 3, ,5769 3, ,0865 4, ,6646 5, ,0853 5, ,3228 3, ,9470 4, ,0190 3, ,3452 3, ,6657 5, ,8738 5, ,3689 3, ,1833 3, ,0311 7, ,2968 4, ,6928 4, ,6669 5, ,6444 4, ,2035 4, ,6951 2, ,7862 3, ,2519 3, ,4576 4, ,8098 3, ,6703 3, ,6207 4, ,9233 4, ,8772 4, ,2957 4, ,8311 4, ,3193 4, ,4836 3, ,8559 3, ,7862 3, ,4104 5, ,9256 3, ,4634 2, ,2438 6, ,9268 3, ,6006 3, ,4588 4, ,8490 6, ,5297 4, ,8098 3, ,0865 4, ,3216 3, ,0156 5, ,8548 4, ,0899 3, ,8582 2, ,6242 3, ,9210 5, ,0403 4,5192 Área (µm 2 ) Diâmetro (µm) ,3182 4, ,3429 4, ,0853 5,0570 xxiv

25 Tabela F.15 Distribuição dos diâmetros das leveduras, no ensaio A da parte II da investigação. Bloco (µm) Frequência % Acumulada 1 0 0,00% 2 0 0,00% 3 4 5,80% ,58% ,26% ,65% ,55% ,00% ,00% ,00% Mais 0 100,00% ,00% Frequência Frequência % acumulada 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 5 20,00% Mais Diâmetro (µm),00% Figura F.3. Distribuição do diâmetro das leveduras, frequência e percentagem acumulada no ensaio A da parte II da investigação. xxv

26 Tabela F.16 Contagem de bacilos e leveduras, para cada fotografia captada, ao longo do volume recolhido, no ensaio A da parte II da investigação. Volume (ml) Foto Nº total Célula Leveduras Bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos leveduras bacilos xxvi

27 Tabela F.17 Determinação da concentração de bacilos, ao longo do volume recolhido, no ensaio A da parte II da investigação. Volume (ml) Tabela F.18 Determinação da concentração de leveduras, ao longo do volume recolhido, no ensaio A da parte II da investigação. Volume (ml) Nº células Nº células Media do nº células nas 25 imagens Media do nº células nas 25 imagens Concentração (nº células/µm 2 ) Concentração (nº células/µm 2 ) Concentração (nº células /mm 2 ) Concentração (nº células /mm 2 ) Concentração lamela (nº células /mm 2 ) Concentração lamela (nº células /mm 2 ) Concentração lamela (nº células /µl) 1 0 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0, ,0400 0,0000 0, , , ,0800 0,0000 0, , , ,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0, ,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0, ,0800 0,0000 0, , , ,0400 0,0000 0, , , ,0400 0,0000 0, , , ,0400 0,0000 0, , , ,1200 0,0000 1, , , ,1200 0,0000 1, , , ,1600 0,0000 1, , , ,0800 0,0000 0, , , ,1600 0,0000 1, , , ,1600 0,0000 1, , , ,2000 0,0000 2, , , ,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0, ,0800 0,0000 0, , ,8451 Concentração lamela (nº células /µl) 1 2 0,0800 0,0000 0, , , ,0800 0,0000 0, , , ,0400 0,0000 0, , , ,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0, ,0400 0,0000 0, , , ,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0, ,0800 0,0000 0, , , ,1200 0,0000 1, , , ,0800 0,0000 0, , , ,2800 0,0000 2, , , ,3600 0,0000 3, , , ,1600 0,0000 1, , , ,1600 0,0000 1, , , ,1600 0,0000 1, , , ,1200 0,0000 1, , , ,0800 0,0000 0, , , ,0400 0,0000 0, , , ,0800 0,0000 0, , ,8451 xxvii

28 Tabela F.19 Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no ensaio A da parte II da investigação. Volume (ml) Bacilos presentes na Leveduras presentes na lamela (nº células/µl) lamela (nº células/µl) Nº células / µl L. bulgaricus - - S. cerevisiae Figura F.4. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no ensaio A da parte II da investigação. xxviii

29 Nº células / µl L.bulgaricus S.cerevisiae Aprox. Lorentz L.bulgaricus Aprox. Lorentz S.cerevisiae Figura F.5. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, com aproximação de Lorentz, no ensaio A da parte II da investigação. Nº células / µl L. bulgaricus S.cerevisiae Aprox. Lorentz S.cerevisiae Aprox. Lorentz L. bulgaricus Figura F.6. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, com aproximação de Lorentz depois de remover alguns pontos, no ensaio A da parte II da investigação. 110 Nº células / µl L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. Gauss L. bulgaricus Aprox. Gauss S. cerevisiae Figura F.7. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, com aproximação de Gauss depois de remover alguns pontos, no ensaio A da parte II da investigação. xxix

30 Os gráficos ilustrados da Figura F.4. à Figura F.7. foram esboçados com o auxílio do programa OriginPro 7.0. Depois de remover alguns pontos e acrescentar funções de aproximação aos dados, ao analisar os gráficos alcançados, conclui-se que a aproximação de Lorentz, no caso do ensaio A da parte II da investigação, é a que se ajusta melhor. Os resultados que se apresentam, de imediato, para os outros ensaios foram tratados de igual forma. Assim, no caso do ensaio B, tem-se: Tabela F.20 Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no ensaio B da parte II da investigação. Volume (ml) Bacilos presentes na lamela (nº células/µl) Leveduras presentes na lamela (nº células/µl) Nº células / µl L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. Lorentz L. bulgaricus Aprox. Lorentz S. cerevisiae Figura F.8. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, com aproximação de Lorentz depois de remover alguns pontos, no ensaio B da parte II da investigação. xxx

31 No caso do ensaio C obtiveram-se muito maus resultados pelo que os valores são expostos sem qualquer tipo de aproximação. Tabela F.21 Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no ensaio C da parte II da investigação. Volume (ml) Bacilos presentes na lamela (nº células/µl) Leveduras presentes na lamela (nº células/µl) Nº células / µl L. bulgaricus S. cerevisiae Figura F.9. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no ensaio C da parte II da investigação. xxxi

32 Para o ensaio D: Tabela F.22 Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no ensaio D da parte II da investigação. Volume (ml) Bacilos presentes na lamela (nº células/µl) Leveduras presentes na lamela (nº células/µl) Nº células / µl L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. Lorentz L. bulgaricus Aprox. Lorentz S. cerevisiae Figura F.10. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, com aproximação de Lorentz depois de remover alguns pontos, no ensaio D da parte II da investigação. xxxii

33 Para o ensaio E: Tabela F.23 Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no ensaio E da parte II da investigação. Volume (ml) Bacilos presentes na lamela (nº células/µl) Leveduras presentes na lamela (nº células/µl) Nº células / µl L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. Lorentz L. bulgaricus Aprox. Lorentz S. cerevisiae Figura F.11. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, com aproximação de Lorentz depois de remover alguns pontos, no ensaio E da parte II da investigação. xxxiii

34 No caso do ensaio D: Tabela F.24 Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no ensaio F da parte II da investigação. Volume (ml) Bacilos presentes na lamela (nº células/µl) Leveduras presentes na lamela (nº células/µl) Nº células / µl L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. S. cerevisiae Aprox. L. bulgaricus Figura F.12. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, com aproximação de Lorentz depois de remover alguns pontos, no ensaio F da parte II da investigação. Reunindo os resultados da parte I e II, para colunas com um intervalo de porosidade entre 0,217 e 0,227, a distância entre o pico das leveduras (primeiro pico) e o dos bacilos (segundo pico) situa-se entre 6 ml e 8 ml. O gráfico da Figura F.13. ilustra isso mesmo, xxxiv

35 tendo-se normalizado a concentração das células pelo seu valor máximo, e feito um ajuste pela distribuição Gaussiana. 1,4 Concentração normalizada (nº células/µl) 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. Gauss L. bulgaricus Aprox. Gauss S. cerevisiae 0, Figura F.13. Variação da concentração normalizada de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, com aproximação de Gauss, baseada nos resultados obtidos da parte I e II. PARTE III Depois dos ensaios realizados com Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus bulgaricus, testou-se, para o mesmo empacotamento de esferas, o comportamento de microesferas verde fluorescente de 1 µm de diâmetro, e para comparação, diferentes soluções de azul dextrano. Uma vez que as microesferas contêm no seu interior um corante fluorescente, e é conhecida a sua concentração inicial (quer em termos de massa por volume, quer a nível do número de células por volume), a sua concentração final (depois de um ensaio de filtração) poderia ser medida num espectrofotómetro. As esferas apresentam excitação máxima a 468 nm e emissão máxima a 508 nm. Inicialmente, tentou-se fazer uma curva de calibração para as microesferas a 468 nm num espectrofluorímetro, que como o nome indica, é próprio para partículas fluorescentes. A escala de unidades de fluorescência, neste aparelho, vai de 0,01 a 900. Para uma concentração de 1,80E+08 nº esferas/ml o aparelho registou um valor médio de 9,133, que é um valor extremamente baixo. Como para o empacotamento binário a testar não se devem usar concentrações de células com ordem superior à dezena de milhões por mililitro, conclusão que foi tirada no final da parte I, decidiu-se usar outros espectrofotómetros. Na tentativa de encontrar o comprimento de onda onde as microesferas apresentariam o pico de absorvência, achou-se, no espectrofotómetro JASCO, o espectro de absorção das microesferas que é apresentado na Figura F.14. xxxv

36 Figura F.14. Espectro de absorção das microesferas verde fluorescente obtido no espectrofotómetro JASCO, entre 300 nm e 700 nm, a uma velocidade de varrimento de 1000 nm/min. Este espectro não deu também bons resultados. O que acontece é que as microesferas têm valores elevados de absorvência a vários comprimentos de onda. Posto isto, resolveu-se utilizar o espectrofotómetro ELISA. Estudaram-se os valores de absorvência obtidos a 468nm, a 568 nm e a 600 nm, para concentrações distintas de microesferas. Nesta fase interessava, principalmente, saber o ponto em que as esferas sairiam da coluna. Ao experimentar traçar a curva de calibração, nos comprimentos de onda referidos no parágrafo anterior, a equação obtida foi idêntica para os comprimentos de onda distintos, períodos de tempo diferentes e exposição à luz natural diferente. Por este motivo, embora os valores não sejam alcançados da forma mais legítima (esta seria pelo espectrofluorímetro), e porque vai ser calculada a razão dos valores de concentração ou estes vão ser normalizados, a partir daqui, decidiu-se usar o espectrofotómetro ELISA, a 468 nm. De imediato apresenta-se a curva de calibração para as microesferas nestas condições. Tabela F.25 Concentração de microesferas versus absorvência, registada no espectrofotómetro ELISA a 468 nm. Conc. Microesferas (g/ml) Conc. Microesferas (nº esf/ml) 1ª Leitura 2ª Leitura Absorvência (468 nm) 3ª Leitura Valor médio Valor médio Branco 0, ,00 0,021 0,029 0,019 0,023 0,000 0, ,70E+08 0,898 0,896 0,901 0,898 0,875 0, ,08E+08 0,445 0,439 0,444 0,443 0,420 0, ,10E+07 0,339 0,339 0,350 0,343 0,320 0, ,40E+07 0,253 0,242 0,244 0,246 0,223 0, ,70E+07 0,135 0,134 0,151 0,140 0,117 0, ,35E+07 0,089 0,079 0,076 0,081 0,058 0, ,75E+06 0,050 0,051 0,061 0,054 0,031 xxxvi

37 0,010 Concentração microesferas (g/ml) 0,008 0,006 0,004 0,002 Regressão linear para as microesferas Conc. microesferas (g/ml) = 0,017*Abs. (468 nm) - 0, R = 0, ,000 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Absorvência (468 nm) Figura F.15. Curva de calibração das microesferas verde fluorescente obtida no espectrofotómetro ELISA a 468nm. Para um leito com porosidade 0,227, a filtração de 5mL de uma solução de microesferas com 2,70E+08 nº esferas/ml ou 0,015 g/ml, deu origem à Figura F.16. 0,18 Razão da Concentração de Microesferas 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0, Figura F.16. Variação da razão da concentração de microesferas ao longo do volume recolhido, partindo de uma concentração inicial de 0,015 g/ml. Em seguida, testou-se o comportamento do azul dextrano. Para encontrar o comprimento de onda para o qual o azul dextrano teria o pico de absorvência, achou-se, no espectrofotómetro JASCO, o espectro de absorção que é apresentado na Figura F.17. xxxvii

38 1,4 1,2 1,0 Abs. 0,8 0,6 0,4 0,2 0, Comprimento de onda (nm) Figura F.17. Espectro de absorção do azul dextrano obtido no espectrofotómetro JASCO, entre 190 nm e 800 nm, a uma velocidade de varrimento de 1000 nm/min. Pelo resultado do espectro do azul dextrano, nota-se que é possível medir absorvências a 620 nm, utilizando-se também o espectrofotómetro ELISA. Foi nestas condições que se obtiveram a tabela e gráfico subsequentes. Tabela F.26 Concentração de azul dextrano versus absorvência, registada no espectrofotómetro ELISA a 620 nm. Conc. Azul Absorvência (620 nm) dextrano (mg/l) 1ª Leitura 2ª Leitura 3ª Leitura Valor médio Valor médio Branco 2500,0 1,181 1,177 1,174 1,141 1, ,0 0,955 0,950 0,948 0,915 0, ,0 0,740 0,722 0,732 0,699 0, ,0 0,500 0,505 0,503 0,469 0, ,0 0,378 0,379 0,378 0,345 0, ,0 0,262 0,293 0,270 0,236 0, ,0 0,143 0,146 0,144 0,110 0, ,0 0,089 0,090 0,089 0,056 0,088 62,5 0,068 0,062 0,063 0,030 0,060 0,0 0,034 0,033 0,033 0,000 0,033 xxxviii

39 2500 Concentração azul dextrano (mg/l) Regressão linear para o Azul dextrano Conc. Azul Dextrano (mg/l) =2182,098* Abs.(620 nm)-4,307 2 R =0, ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Absorvência (620 nm) Figura F.18. Curva de calibração do azul dextrano obtida no espectrofotómetro ELISA a 620 nm. Estabelecida a curva de calibração realizaram-se ensaios com concentrações distintas de azul dextrano. Para um leito com porosidade 0,227, testou-se a filtração de um volume de 5 ml com diferentes soluções de azul dextrano, descritas no gráfico da Figura F.19. 0,5 Razão da Conc. de Azul Dextrano 0,4 0,3 0,2 0,1 Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 0, Figura F.19. Variação da razão da concentração de azul dextrano ao longo do volume recolhido, partindo de uma concentração inicial de 2500 mg/l no ensaio 1 e 2, e de uma concentração inicial de 1000 mg/l no ensaio 3. Para certificar alguns dos resultados conseguidos, realizaram-se alguns ensaios extra numa mistura idêntica de esferas. Assim, para uma porosidade de 0,227 realizou-se a filtração de 5 ml de uma solução de leveduras, de 5 ml de uma solução de bacilos, e de 5 ml de uma mistura de bacilos e microesferas. xxxix

40 Uma vez que a determinação da concentração das microesferas e do azul dextrano era determinada no espectrofotómetro ELISA, decidiu-se que era melhor passar a medir a concentração dos microrganismos também neste aparelho. De acordo com o procedimento apresentado no Apêndice D (determinação da concentração por turbidimetria) as curvas obtidas para os bacilos e leveduras, no espectrofotómetro ELISA, foram respectivamente: Conc. bacilos ( g/l) = DO(620 nm) R 2 = Conc. leveduras (g/l) = DO(620 nm) R 2 = Apresentam-se em breve as observações registadas ao longo dos ensaios extra para o empacotamento binário. 0,30 0,25 Razão da Conc. de céllulas 0,20 0,15 0,10 0,05 S. cerevisiae 0, Figura F.20. Variação da razão da concentração de S. cerevisiae ao longo do volume recolhido, partindo de uma concentração inicial de 0,358 g/l 1,2 1,1 Razão da Conc. de células 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 L. bulgaricus 0, Figura F.21. Variação da razão da concentração de L. bulgaricus ao longo do volume recolhido, partindo de uma concentração inicial de 0,194 g/l xl

41 1,1 1,0 0,9 L. bulgaricus Microesferas Razão da Conc. de células 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, Figura F.22. Variação da razão da concentração de Microesferas e L. bulgaricus ao longo do volume recolhido, partindo de uma concentração inicial de 10,9 g/l e 0,208 g/l, respectivamente. PARTE IV Depois dos ensaios realizados com o empacotamento binário decidiu-se avaliar o comportamento das mesmas partículas e microrganismos num leito formado pelas partículas de menor tamanho do empacotamento binário e com uma quantidade de esferas de d = µm idêntica. O empacotamento originado apresentava uma altura de 5.6 cm e ficou com uma porosidade de Realizaram-se duas filtrações com o azul dextrano, microesferas e Lactobacillus bulgaricus, em separado. Apresentam-se agora as observações médias registadas. Razão da Conc. de células 1,1 1,0 0,9 0,8 1 0,7 0,6 0,5 2 0,4 0,3 0,2 0,1 0, Figura F.23. Variação da razão da concentração de 1 azul dextrano com concentração inicial C 0 = 1000 mg/l e 2 microesferas com concentração inicial C 0 = mg/l ao longo do volume recolhido. xli