Efeito da Concentração do Cloreto de Sódio na Eclosão de Dáfnias

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1 Efeito da Concentração do Cloreto de Sódio na Eclosão de Dáfnias Nuno Lapa e Rui Barbosa Universidade Nova de Lisboa (UNL) Faculdade de Ciências e Tecnologia (FCT) Unidade de Biotecnologia Ambiental (UBiA) Campus da Caparica, Ed. Departamental, piso 3, gab. 377-B, Caparica, Portugal 1. Objectivo O objectivo deste protocolo de trabalho é a determinação do efeito de diferentes concentrações de Cloreto de Sódio (NaCl) na eclosão do organismo Daphnia magna. Um conjunto de efípios de D. magna é exposto a concentrações crescentes de NaCl, durante 72 h, em condições controladas de luz e temperatura. Será registado o número de indivíduos que eclodiram e que apresentam mobilidade e o número de indivíduos que eclodiram mas que não apresentam mobilidade, após 72 h de incubação. Por comparação com o ensaio em que os efípios foram colocados em água com características padronizadas para a eclosão das dáfnias, determinar-se-ão as percentagens de redução no número de dáfnias eclodidas. 2. Materiais e Equipamentos 1) Dois tubos com efípios de dáfnias; 2) Um micro-crivo; 3) Dois tubos com Spirulina para alimentar as dáfnias; 4) Treze placas de Petri, de plástico, de 15 ml; 5) Seis balões volumétricos de 100 ml; 6) Cinco balões volumétricos de 1000 ml; 7) Bomba de arejamento de aquário; 8) Balanças para pesar reagentes sólidos (precisão: ±0,01 g); 9) Pipetas de vidro graduadas (5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml); 10) Câmara de incubação com controlo de temperatura e iluminação; 11) Pinças ou espátulas; 12) Folha de cartolina preta; 13) Etiquetas para identificar os balões com as soluções que neles estão contidas. 3. Reagentes 1) Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO 3 ); 1

2 2) Cloreto de cálcio dihidratado (CaCl 2.2H 2 O); 3) Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO 4.7H 2 O); 4) Cloreto de potássio (KCl); 5) Cloreto de sódio (NaCl). É necessária, ainda, água desionizada. Se forem utilizados reagentes com outros níveis de hidratação, as preparações indicadas na Tarefa 4 (Dia 1) terão que ser corrigidas em conformidade. 4. Programa de Trabalho para o Dia 1 Tarefa 1 Apresentação dos docentes e dos estagiários Ciência Viva Tarefa 2 Apresentação do programa de trabalho Tarefa 3 Apresentação dos laboratórios onde o trabalho será realizado Tarefa 4 Preparação da solução de eclosão das dáfnias, designada por Água de Diluição A Água de Diluição é uma solução que contém um conjunto de sais essenciais à eclosão das dáfnias. Esta solução é composta por hidrogenocarbonato de sódio, cloreto de cálcio, sulfato de magnésio e cloreto de potássio. Devem ser preparadas quatro soluções individuais, contendo, cada uma delas, cada um destes sais. Estas quatro soluções são preparadas do seguinte modo: 1) Preparação das soluções individuais a. Solução de hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO 3 ): Identificar um balão volumétrico de um litro com a indicação 2,59 g NaHCO 3 /L. Dissolver 2,59 g de NaHCO 3 em água desionizada e perfazer esta solução a um litro. Agitar esta solução (Solução 1); b. Solução de cloreto de cálcio dihidratado (CaCl 2.2H 2 O): Identificar um balão volumétrico de um litro com a indicação 11,76 g CaCl 2.2H 2 O/L. Dissolver 11,76 g de CaCl 2.2H 2 O em água desionizada e perfazer esta solução a um litro. Agitar esta solução (Solução 2); c. Solução de sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO 4.7H 2 O): Identificar um balão volumétrico de um litro com a indicação 4,93 g MgSO 4.7H 2 O/L. Dissolver 4,93 g de MgSO 4.7H 2 O em água desionizada e perfazer esta solução a um litro. Agitar esta solução (Solução 3); d. Solução de cloreto de potássio (KCl): Identificar um balão volumétrico de um litro com a indicação 0,23 g KCl/L. Dissolver 0,23 g de KCl em água desionizada e perfazer esta solução a um litro. Agitar esta solução (Solução 4). 2

3 Após se ter preparado estas quatro soluções, deve ser preparada a Água de Diluição, do seguinte modo: 1) Identificar um balão volumétrico de um litro com a indicação Água de Diluição ; 2) Adicionar água desionizada ao balão volumétrico identificado em 1) até, cerca de, metade da sua capacidade. Adicionar 25 ml da Solução 1 a esse balão volumétrico e agitar de modo a dissolver esta solução; 3) Adicionar 25 ml da Solução 2 ao balão volumétrico e agitar de modo a dissolver esta solução; 4) Adicionar 25 ml da Solução 3 a esse balão volumétrico e agitar de modo a dissolver esta solução; 5) Adicionar 25 ml da Solução 4 a esse balão volumétrico e agitar de modo a dissolver esta solução; 6) Perfazer com água desionizada. Agitar esta solução. Tarefa 5 Arejamento da Água de Diluição A Água de Diluição deve ser arejada durante, pelo menos, 30 minutos, antes de ser colocada em contacto com os efípios. O arejamento pode ser efectuado através de uma bomba de arejamento de um aquário, à qual se encontra ligado um tubo de plástico. Na ponta do tubo de plástico deverá ser ligada uma pipeta. Esta deverá ser introduzida no balão que contém a Água de Diluição e a bomba de aquário deverá ser colocada em funcionamento, com um arejamento suficientemente forte, mas evitando que a água seja expelida para fora do balão. Tarefa 6 Conservação da Água de Diluição A Água de Diluição pode ser conservada num frigorífico, na ausência de luz. Nestas condições de conservação, esta solução mantém-se estável durante cerca de 3 a 4 dias. Sempre que a Água de Diluição for conservada no frio, ela deve ser retirada do frigorífico algumas horas antes do início do teste, de modo a garantir que a sua temperatura atinja, gradualmente, a temperatura ambiente. Tarefa 7 Preparação das soluções de NaCl Sugere-se a preparação, em balões de 100 ml, das concentrações de NaCl indicadas no Quadro 1. C0 (g NaCl/L) Quadro 1. Concentrações de NaCl que serão testadas C1 C2 C3 C4 (g NaCl/L) (g NaCl/L) (g NaCl/L) (g NaCl/L) C5 (g NaCl/L) 0 0,137 0,547 2,188 8,

4 Metodologia para a preparação das soluções da NaCl: 1. Identificar seis balões volumétricos, de 100 ml, com os códigos C0 a C5; 2. Perfazer o balão C0 com Água de Diluição até à marca de 100 ml; 3. Dissolver 3,5 g de NaCl com Água de Diluição no balão volumétrico C5. Perfazer com Água de Diluição a 100 ml. Agitar até se atingir a dissolução completa do NaCl; 4. Transferir 25 ml da solução do balão C5 para o balão volumétrico C4. Perfazer com Água de Diluição a 100 ml. Agitar; 5. Transferir 25 ml da solução do balão C4 para o balão volumétrico C3. Perfazer com Água de Diluição a 100 ml. Agitar; 6. Transferir 25 ml da solução do balão C3 para o balão volumétrico C2. Perfazer com Água de Diluição a 100 ml. Agitar; 7. Transferir 25 ml da solução do balão C2 para o balão volumétrico C1. Perfazer com Água de Diluição a 100 ml. Agitar. 5. Programa de Trabalho para o Dia 2 Tarefa 8 Preparação das placas de Petri destinadas à incubação dos efípios Identificar 12 placas de Petri, de plástico, de 15 ml, tal como indicado no Quadro 2. Quadro 2. Códigos que deverão ser atribuídos às placas de Petri onde os efípios serão incubados Ensaio Concentração de NaCl C0 C1 C2 C3 C4 C5 1 C0/1 C1/1 C2/1 C3/1 C4/1 C5/1 2 C0/2 C1/2 C2/2 C3/2 C4/2 C5/2 Transferir, dos balões volumétricos de 100 ml que contêm as soluções da NaCl com as concentrações C0 a C5, cerca de 15 ml para as respectivas placas de Petri, de acordo com as indicações do Quadro 3. Quadro 3. Volumes das soluções de NaCl (C0 a C5) que deverão ser colocados nas placas de Petri de incubação dos efípios (C0/1 a C5/2) Placa de Petri Solução de NaCl (balão volumétrico) Volume da solução de NaCl (ml) C0/1 C0 15 C0/2 C0 15 C1/1 C1 15 C1/2 C1 15 C2/1 C2 15 C2/2 C2 15 C3/1 C3 15 C3/2 C3 15 4

5 Quadro 3. (cont.) Placa de Petri Solução de NaCl (balão volumétrico) Volume da solução de NaCl (ml) C4/1 C4 15 C4/2 C4 15 C5/1 C5 15 C5/2 C5 15 Tarefa 9 Lavagem dos efípios A lavagem dos efípios deve realizar-se do seguinte modo: a) Colocar, no microcrivo, todo o conteúdo dos dois recipientes onde se encontram os efípios; b) Lavar os efípios com água da torneira, de modo a remover o meio de conservação. O caudal de água deve ser regulado, de modo a não serem expelidos efípios para fora do microcrivo; c) Identificar uma placa de Petri, de 15 ml, com a seguinte denominação Lavagem de Efípios; Data: DD/MM/AAAA; Hora: hh:min ; d) Transferir os efípios para a placa de lavagem, fazendo passar 15 ml de Água de Diluição, previamente arejada, pelo fundo do crivo, em sentido contrário ao que se fez passar a água da torneira. O objectivo é o de libertar os efípios na placa de lavagem, com o auxílio da água de diluição. Tarefa 10 Transferência dos efípios para as placas de Petri que contém as soluções de NaCl Com o auxílio de uma espátula ou de uma pinça, transferir cinco efípios para cada uma das placas de Petri (C0/1 a C5/2) que contêm as soluções de NaCl. Deverá evitar-se a transferência de uma grande quantidade de água do meio onde os efípios foram lavados. Tarefa 11 Incubação dos efípios Efectuar a incubação dos efípios do seguinte modo: a) Tapar as doze placas de Petri com as tampas; b) Incubar, durante 72 h, entre 20 e 22ºC, sob luz contínua, numa câmara de incubação. Os primeiros efípios deverão nascer um pouco antes das 72 h de incubação. A maioria deles nascerá entre as 72 e as 80h. Tarefa 12 Pesquisa bibliográfica Iniciar uma pesquisa bibliográfica sobre Que organismos são as dáfnias, qual é o seu ciclo de vida e como é que o NaCl as afecta. 5

6 Esta pesquisa deverá permitir que os estagiários preparem a Introdução para o trabalho. 6. Programa de Trabalho para o Dia 3 Tarefa 13 Pesquisa bibliográfica Continuar a pesquisa bibliográfica sobre Que organismos são as dáfnias, qual é o seu ciclo de vida e como é que o NaCl as afecta. Tarefa 14 Discussão sobre a informação recolhida na pesquisa bibliográfica Os estagiários deverão reunir-se para darem a conhecer, uns aos outros, quais foram os resultados das suas pesquisas bibliográficas. Devem trocar a informação obtida e todos devem ler a informação que os colegas lhes forneceram. 7. Programa de Trabalho para o Dia 4 Tarefa 15 Preparação de slides para uma apresentação oral do trabalho realizado no estágio Os estagiários deverão dar início à preparação de slides que irão suportar uma apresentação oral (em grupo) do trabalho realizado no estágio e dos resultados obtidos. A apresentação deverá ser, no máximo, de 20 minutos e deverá incluir os seguintes aspectos: a) Introdução ao tema estudado; b) Material utilizado; c) Procedimento experimental; d) Resultados obtidos; e) Conclusões; f) Propostas para trabalhos futuros; g) Bibliografia. 8. Programa de Trabalho para o Dia 5 Tarefa 16 Leitura e registo do número de dáfnias eclodidas 72 h após o início da incubação dos efípios, deve proceder-se à leitura e registo, em cada uma das placas de Petri, da seguinte informação: 6

7 a) Número de dáfnias com mobilidade (Dm); b) Número de dáfnias sem mobilidade (Dim). A soma de Dm com Dim dará o número total de dáfnias que eclodiram. Dim representará as dáfnias que eclodiram, mas que foram afectadas pela concentração de NaCl no meio de cultura. A contagem das dáfnias móveis e imóveis, em cada uma das placas de Petri, será facilitada se se colocar uma folha de cartolina preta debaixo das placas. O registo dos números de dáfnias móveis e imóveis poderá ser feito num quadro semelhante ao Quadro 4. Quadro 4. Exemplo de um quadro de registo de resultados Placa de Petri Nº de dáfnias móveis Nº de dáfnias imóveis C0/1 C0/2 C1/1 C1/2 C2/1 C2/2 C3/1 C3/2 C4/1 C4/2 C5/1 C5/2 Tarefa 17 Tratamento dos resultados Os estagiários deverão proceder ao tratamento dos resultados obtidos, preferencialmente numa folha de cálculo (por exemplo, Microsoft Excel). Deverão incluir: a) O cálculo do número total de dáfnias eclodidas para cada concentração de NaCl; b) O cálculo da percentagem de dáfnias não eclodidas (percentagem de efeito do NaCl na eclosão de dáfnias); c) O cálculo da percentagem de dáfnias eclodidas, mas que não apresentam mobilidade (percentagem de efeito do NaCl na mobilidade das dáfnias juvenis); d) Qualquer outro cálculo que julguem ser pertinente. Os resultados deverão ser apresentados preferencialmente sob a forma de gráficos, que demonstrem a relação entre as concentrações de NaCl testadas e as percentagens de efeito do sal na eclosão e na mobilidade das dáfnias. Continuação da Tarefa 15 Preparação de slides para uma apresentação oral do trabalho realizado no estágio 7

8 Após o tratamento dos resultados estar completo, os estagiários deverão continuar a preparar os slides para a apresentação oral. 9. Programa de Trabalho para o Dia 6 Conclusão da Tarefa 15 Preparação de slides para uma apresentação oral do trabalho realizado no estágio Os estagiários deverão concluir a preparação dos slides para a apresentação oral. 10. Programa de Trabalho para o Dia 7 Tarefa 18 Apresentação oral do trabalho realizado e dos resultados obtidos No último dia do estágio, os estagiários irão efectuar a apresentação oral do trabalho realizado e dos resultados obtidos. Tal como foi indicado na Tarefa 15, a apresentação oral deve ser apoiada nos slides que foram preparados pelos estagiários, devendo incluir os pontos que se encontram indicados na Tarefa 15 (Programa de Trabalho para o Dia 4). A apresentação oral não deverá exceder 20 minutos. Tratando-se de uma apresentação em grupo, todos os estagiários deverão comunicar uma parte da apresentação oral, isto é, todos devem falar durante a apresentação oral. Após a apresentação, os orientadores do estágio têm disponível um período de 10 minutos para a colocação de questões/comentários/sugestões. Tarefa 19 Entrega dos Diplomas de Realização de Estágio Ciência Viva No final da apresentação oral, o investigador responsável pelos estágios procederá à entrega dos Diplomas de Realização de Estágio Ciência Viva. Tarefa 20 Resposta aos inquéritos Ciência Viva Os estagiários e o investigador responsável pelos estágios deverão responder ao inquérito Ciência Viva sobre a qualidade do estágio. Com esta tarefa, o estágio encontra-se concluído. 8