MF-447.R-1 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLÔNIAS (U.F.C.) DE COLIFORMES TOTAIS, PELA TÉCNICA DE MEMBRANAS FILTRANTES

Transcrição

1 MF-447.R-1 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLÔNIAS (U.F.C.) DE COLIFORMES TOTAIS, PELA TÉCNICA DE MEMBRANAS FILTRANTES Notas: Aprovado pela Deliberação CECA n 1570, de 02 de outubro de 1989 Publicado no DOERJ de 28 de novembro de OBJETIVO Definir o método de determinação de unidades formadoras de colônias (u.f.c.) de coliformes totais em amostras de água destinada ao consumo humano, pela técnica de membranas filtrantes. 2. DOCUMENTO DE REFERÊNCIA - MN MANUAL DE AMOSTRAGEM DE QUALIDADE DE ÁGUA 3. DEFINIÇÕES Para os efeitos deste método são adotadas as seguintes definições: 3.1 BACILOS Designação dada a certas bactérias que se apresentam sob a forma de bastonetes. 3.2 COLORAÇÃO DE GRAM Coloração diferencial através da qual as bactérias são classificadas em Gram-positivas e Gram-negativas, dependendo da retenção ou não do corante cristal violeta. 3.3 ESPOROS Corpúsculos esféricos ou ovóides que se formam em certas bactérias, mais resistentes aos efeitos do calor, dessecação, congelamento, drogas deletérias e radiações do que as próprias células que os formam. 3.4 COLIFORMES TOTAIS (GRUPO COLIFORME) Bacilos Gram-negativos, não formadores de esporos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, que apresentam a propriedade de formar colônias escuras com brilho metálico esverdeado, dentro de 24 horas a 35 ºC, em meio tipo Endo contendo lactose.

2 3.5 M-ENDO AGAR LES Meio de cultura seletivo e diferencial em que, na fermentação da lactose pelas bactérias do grupo coliforme, forma-se um aldeído como produto intermediário, o qual se complexa com sulfito de sódio e fucsina básica, conferindo às colônias de coliformes uma coloração escura característica com brilho metálico esverdeado, superficial. 3.6 CALDO LACTOSE VERDE BRILHANTE BILE - C.L.V.B.B. Meio seletivo em que se obtém a inibição de bactérias Gram-positivas e de esporulados fermentadores da lactose, permitindo um bom desenvolvimento de bactérias do grupo coliforme. 3.7 CALDO LACTOSADO - C.L. Meio de enriquecimento no qual as concentrações de lactose e peptona fornecem condições ótimas para o crescimento de bactérias do grupo coliforme. 4. PRINCÍPIO As bactérias do grupo coliforme fermentam a lactose contida no meio M- Endo Agas LES, formando aldeído que complexa com o sulfito de sódio e fuscina, conferindo às colônias de coliformes uma coloração escura característica, com brilho metálico esverdeado. 5. RESUMO DA TÉCNICA A técnica para determinação consiste na filtração de amostra de água através de membrana filtrante com porosidade de 0,45 m e posterior cultura em meio seletivo e diferencial. As bactérias que apresentarem maiores dimensões, serão retidas na superfície da membrana, a qual será colocada em uma placa de Petri contendo o meio de cultura M-ENDO AGAR LES. O meio de cultura, por capilaridade, se difundirá através da membrana entrando em contato com as bactérias e, após um período de incubação de 24 horas a 35 ± 0,5 ºC, se desenvolverão colônias com características típicas que poderão ser observadas diretamente com o auxílio de microscópio estereoscópico. 6. APLICABILIDADE Aplicável unicamente as águas destinadas ao consumo humano.

3 7. INTERFERÊNCIAS Para evitar interferências, a amostra deve ser coletada e preservada de acordo com o MN-707. O cloro residual presente na amostra pode levar a resultados falsos, devendo ser neutralizado no momento da coleta. A temperatura da amostra e o tempo decorrido entre a coleta e a análise também podem interferir nos resultados. A temperatura da amostra deve ser mantida entre 4 e 10 ºC até o início da análise, que deverá ocorrer no prazo máximo de 30 horas, preferencialmente dentro de 8 horas. 8. APARELHAGEM E MATERIAL 8.1 Os equipamentos e a vidraria necessários para a realização dos testes consistem em: - Autoclave - Incubadora bacteriológica regulada para 35 ± 0,5 ºC. - Medidor de ph - Balanças com precisão de 0,1 mg e 0,1 g - Microscópio estereoscópio binocular - Placas de Petri de plástico não tóxico, de 48 x 8,5 mm - Frascos para água de diluição, de borossilicato, com capacidade para conter 90 ml, deixando espaço para permitir boa homogeneização. - Tubos de ensaio de 18 x 180 mm - Tubos de Durhan de 6 x 35 mm - Provetas graduadas de 100 ml - Porta-filtro de vidro ou aço inoxidável - Kitassato - Bomba de vácuo - Membrana filtrante de 47 mm de diâmetro com porosidade de 0,45 m, branca, quadriculada, isenta de substâncias tóxicas - Pinça de aço inoxidável com extremidade arredondada 8.2 Todo material que entre em contato com a amostra deve ser quimicamente inerte, preferencialmente de vidro, com exceção das placas de Petri. 8.3 Todo material de vidro deve ser esterilizado a seco, antes do uso. As placas de Petri devem ser esterilizadas com radiação de ultravioleta, por 30 minutos.

4 9. PRODUTOS QUÍMICOS E SOLUÇÕES 9.1 SOLUÇÃO DE HIDRÓXIDO DE SÓDIO 1 N Pesar 40 g de hidróxido de sódio (NaOH), dissolver em pequena quantidade de água destilada estéril, transferir para balão volumétrico e completar o volume para ml. Guardar em frasco apropriado. 9.2 ÁGUA DE DILUIÇÃO FOSFATADA Preparo da Solução Estoque A Dissolver 34,0 g de fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) em 500 ml de água destilada esteril, ajustar o ph para 7,2 ± 0,1 com solução de hidróxido de sódio 1N e completar o volume para ml com água destilada estéril. Colocar em frasco adequado e guardar na geladeira Preparo da Solução Estoque B Dissolver 81,1 g de cloreto de magnésio (MgCl2.6H2O) em ml de água destilada estéril, colocar em frasco adequado e guardar em geladeira Preparo da água de Diluição Medir 1,25 ml da solução estoque A e 5,0 ml da solução estoque B e dissolver em água destilada, completando o volume a ml. Distribuir em frascos de diluição quantidades que permitam a sua utilização na lavagem do porta-filtro, sem derramamento. Esterilizar em autoclave a 121 C, durante 20 minutos. 9.3 MEIOS DE CULTURA Poderão ser utilizados os meios de cultura prontos, encontrados no comércio sob a forma de pó desidratado, ou então preparados no laboratório, a partir dos ingredientes básicos que devem ser de alta pureza (p.a.) M-Endo Agar LES Pesar 51,0 g do meio desidratado pronto ou pesar 1,2 g de extrato de levedura, 3,7 g de casitona, 3,7 g de tiopeptona, 7,5 g de triptose, 9,4 g de lactose, 3,3 g de fosfato bibásico de potássio (K 2 HPO 4 ), 1,0 g de fosfato monobásico de potássio (KH 2 PO 4 ), 3,7 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,1 g de desoxicolato de sódio, 0,05 g de lauril sulfato de sódio, 1,6 g de sulfito de sódio (Na 2 SO 3 ), 0,8 g de fucsina básica e 15,0 g de agar. Acrescentar ml de água destilada na qual foram diluídos 20 ml de etanol p.a. e

5 deixar em repouso durante aproximadamente 15 minutos. Aquecer em banho-maria, agitando freqüentemente até completa dissolução do agar, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Distribuir de 3 a 3,5 ml em placas de Petri. Não esterilizar em autoclave. ph final: 7,2 ± 0, C.L. de Concentração Simples Pesar 13,0 g do meio desidratado pronto ou pesar 3,0 g de extrato de carne, 5,0 g de peptona e 5,0 g de lactose. Acrescentar ml de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio contendo no seu interior tubos de Durhan invertidos, distribuir volumes de 10 ml. Tampar com algodão ou com cápsulas de alumínio e esterilizar em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 6,9 ± 0,1 a 25 ºC C.L.V.B.B a 2% Pesar 40,0 g do meio desidratado pronto ou pesar 10,0 g de peptona, 10,0 g de lactose, 20,0 g de bile de boi desidratada e 0,0133 g de corante verde brilhante. Acrescentar ml de água destilada fria. Aquecer, agitando frequentemente até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio contendo no seu interior tubos de Durhan invertidos, distribuir 10 ml do meio. Tampar com algodão ou cápsula de alumínio e esterilizar em autoclave a 121 ºC, durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 7,2 ± 0,2 a 25 ºC. 10. PROCEDIMENTO 10.1 Antes de iniciar a análise, desinfetar as bancadas de trabalho com desinfetante que não deixe resíduo Retirar a parte superior do porta-filtro e, com uma pinça flambada e esfriada, colocar uma mambrana filtrante esteril com a face quadriculada voltada para cima, centralizando-a sobre a parte inferior do porta-filtro Acoplar a parte superior do porta-filtro a parte inferior, tendo o cuidado para não danificar a membrana Homogeneizar a amostra, no mínimo 25 vezes, agitando vigorosamente o frasco.

6 10.5 Medir 100 ml da amostra em provetas graduadas estéreis, ou no próprio porta-filtro se este tiver graduação externa Ligar a bomba de vácuo e proceder a filtração Enxaguar o porta-filtro três vezes com porções de 20 a 30 ml de água de diluição estéril, para evitar a retenção de alguma bactéria no porta-filtro Desligar a bomba de vácuo ao finalizar a operação (evitar secagem excessiva da membrana filtrante) Colocar a placa de Petri correspondente, contendo M-Endo Agar LES, em frente ao conjunto de filtração e, com auxílio de uma pinça, entreabri-la Separar a parte superior do porta-filtro e com uma pinça cujas extremidades tenham sido flambadas, retirar com cuidado a membrana, e acoplar novamente a parte superior do porta-filtro à inferior Obedecendo aos cuidados de assepsia, colocar, cuidadosamente, a membrana com a superfície quadriculada voltada para cima, na placa de Petri que contém o meio de cultura Verificar se houve formação de bolhas de ar entre a membrana e o meio de cultura. Se isso ocorrer, levantar uma das bordas da membrana com uma pinça estéril e, fazendo movimentos circulares, deslocar a membrana com a finalidade de eliminá-las, pois as bolhas impedem o contacto das bactérias com o meio de cultura, dificultando ou mesmo impedindo o seu crescimento Lavar novamente o porta-filtro com água de diluição estéril e proceder à próxima filtração Os porta-filtros devem estar estéreis no início de cada série de filtrações e essa não deve envolver mais de 30 amostras. Se houver um intervalo de 30 minutos entre uma filtração e outra, os porta-filtros devem ser esterilizados novamente Incubar as placas com as membranas filtrantes, em posição invertida, sobreportas a papel de filtro úmido ou outro material que conserve a umidade, a 35 ± 0,5 ºC por 22 a 24 horas Após esse período de incubação, efetuar a contagem das colônias típicas de coliformes que apresentem coloração escura com brilho metálico esverdeado recobrindo toda a superfície da colônia ou parte dela. Nessa contagem, usar um microscópio estereoscópico com iluminação fluorescente perpendicular ao plano da membrana.

7 10.17 Se ocorrer crescimento confluente a análise deve ser repetida. A presença de coliformes nas culturas confluentes que não apresentam brilho metálico esverdeado pode ser demonstrada colocando-se a membrana inteira dentro de um tubo de C.L.V.B.B. e observando a produção de gás. Se houver produção de gás depois de 48 horas a 35 ºC, conclui-se que os coliformes estão presentes, mas será necessária nova amostra para análise Ocasionalmente, as bactérias do grupo coliforme podem produzir colônias atípicas (sem o brilho superficial). Se apenas colônias atípicas se desenvolverem na membrana filtrante, e necessário a sua verificação, depois de contadas A verificação de colônias atípicas e feita com o auxílio de uma agulha de inoculação devidamente flambada e esfriada. Colher inóculos de 5 colônias atípicas de cada placa e transferir para tubos de C.L. e de C.L.V.B.B., incubandos a 35 ± 0,5 ºC durante 24 horas, inicialmente Após esse período efetuar a la. leitura, considerando positivos os tubos que apresentaram gás no tubo de Durhan. Os tubos negativos são incubados mais 24 horas, efetuando-se a leitura após esse período Se os tubos de C.L.V.B.B. correspondentes aos tubos de C.L. se apresentarem positivos, não há necessidade de confirmar os de C.L Todos os tubos de C.L. positivos serão repicados imediatamente após as respectivas leituras, utilizando-se o meio de C.L.V.B.B Na confirmação, agitar bem cada tubo de C.L. positivo e, com auxílio de uma alça de inoculação, retirar o material e inocular no tubo de C.L.V.B.B. correspondente, evitando a película superficial que pode se formar no C.L. 11. RESULTADO 11.1 Contar todas as colônias de coliformes totais e expressar o resultado em unidades formadoras de colônias por 100 ml de amostras (u.f.c./100 ml) utilizando a seguinte expressão: N C V x100 onde: N = número de unidades formadoras de colônias de coliformes totais em 100 ml de amostra (u.f.c./ 100 ml) C =número de colônias de coliformes totais V =volume de amostra filtrado, em ml

8 11.2 Se o número de colônias exceder a 200 o resultado deve ser invalidado, sendo necessária nova amostra para análise. 12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 12.1 AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of water and wastewater. 16 th ed., Washington, D.C., U.S.A. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. Microbiological methods for monitoring the environment. Water and wastes. EPA - 600/ , Cincinnati, Dec KLABER, P. W.; CLARCK, H.F. & GELDREICH, E.E. - Sanitary significance of coliform and fecal organism in surface water. Public Health Reports, 79 (1):57-60, 1964.