MF-0407.R-2 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE COLÔNIAS DE BACTÉRIAS QUE PRECIPITAM O FERRO (FERROBACTÉRIAS), PELA TÉCNICA "POUR PLATE"

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1 MF-0407.R-2 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE COLÔNIAS DE BACTÉRIAS QUE PRECIPITAM O FERRO (FERROBACTÉRIAS), PELA TÉCNICA "POUR PLATE" Notas: Aprovado pela Deliberação CECA n 3.966, de 16 de janeiro de 2001 Publicado no DOERJ de 02 de abril de OBJETIVO Definir o método de determinação de colônias de bactérias que precipitam o ferro (ferrobactérias), em amostras de águas ou de efluentes líquidos, pela técnica "Pour Plate". 2 DOCUMENTO DE REFERÊNCIA MN MANUAL DE AMOSTRAGEM DE QUALIDADE DE ÁGUA. 3 DEFINIÇÃO Para os efeitos deste método adota-se a seguinte definição: FERROBACTÉRIAS - grupo de bactérias morfológica e fisiologicamente heterogêneo, com algumas espécies cultivadas em laboratório, que são capazes de metabolizar o ferro reduzido e os compostos orgânicos de ferro solúveis, presente no seu habitat aquoso, e depositar o ferro, na forma de hidróxido férrico hidratado, em suas secreções mucilaginosas. Entre as ferrobactérias de grande interesse em microbiologia da água, por causarem algumas alterações em sua qualidade, pode-se citar: Sphaerotilus, Leptothrix e Gallionella. 4 PRINCÍPIO As ferrobactérias, sob determinadas condições de nutrição, temperatura e tempo de incubação em presença de compostos orgânicos de ferro solúveis, formam colônias com coloração ferruginosa típica. Há evidências de que as ferrobactérias metabolizam a parte orgânica dos compostos orgânicos de ferro, eliminando o ferro, que é depositado em suas secreções mucilaginosas, na forma de hidróxido de ferro.

2 5 RESUMO DA TÉCNICA A técnica "pour plate" para determinação de ferrobactérias consiste na adição do meio de cultura, em estado líquido e estabilizado à temperatura de 45 ( 1) ºC, ao inóculo da amostra. Alíquotas adequadas de diluições decimais sucessivas da amostra são inoculadas em placas de Petri, em duplicatas, adicionando-se, a seguir, o meio de cultura agar citrato férrico amoniacal, previamente fundido e estabilizado. Após determinado período de incubação é feita a contagem das colônias, utilizando-se um contador de colônias tipo Quebec. 6 APLICABILIDADE Aplicável a amostras de água doce ou salgada e de efluentes líquidos. 7 INTERFERÊNCIAS Para evitar interferências, a amostra deve ser coletada e preservada de acordo com o MN APARELHAGEM E MATERIAL 8.1 Autoclave 8.2 Incubadora bacteriológica regulada para 20 ºC 8.3 Balança com precisão de 0,1 mg e 0,1 g 8.4 Medidor de ph 8.5 Contador de colônias tipo Quebec 8.6 Banho-maria regulado para 45 ( 1) ºC 8.7 Pipetas tipo Mohr de 5 ml e 10 ml 8.8 Placas de Petri de 100 x 15 mm 8.9 Tubos de ensaio de 18x 180 mm

3 8.10 Frascos para água de diluição de borosilicato com capacidade para conter 90 ml, deixando espaço para permitir boa homogeneização 8.11 Estante para tubos de ensaio Obs: Todo material que entre em contato com a amostra deve ser quimicamente inerte, preferencialmente de vidro. Todo o material deve ser esterilizado a seco, antes do uso. 9 REAGENTES E SOLUÇÕES 9.1 ÁGUA DESTILADA ESTÉRIL Água destilada autoclavada. 9.2 SOLUÇÃO DE HIDRÓXIDO DE SÓDIO 1 N Pesar 40 g de hidróxido de sódio (NaOH) p.a, dissolver em pequena quantidade de água destilada estéril, transferir para balão volumétrico e completar o volume a ml. Guardar em frasco apropriado. 9.3 AGAR CITRATO FÉRRICO AMONIACAL Pesar e transferir para béquer de 2 litros os seguintes sais: 0,5 g de sulfato de amônia [(NH 4 ) 2.SO 4 ] p.a; 0,5 g de nitrato de sódio (NaNO 3 ) p.a; 0,3 g de fosfato dibásico de potássio (K 2 HPO 4 ) p.a; 0,5 g de sulfato de magnésio (MgSO 4.7H 2 O) p.a; 0,2 g de cloreto de cálcio (CaCl 2.6H 2 O) p.a; 10,0 g de citrato férrico amoniacal; e 15,0 g de agar puríssimo. Acrescentar ml de água destilada fria, deixando em repouso durante aproximadamente 15 minutos. Aquecer em banho-maria agitando freqüentemente até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Distribuir volumes de 15 ml em tubos de ensaio de tamanho adequado. Tampar com bucha de algodão recoberta com gaze e esterilizar em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 6,6 ( 0,1).

4 9.4 SOLUÇÃO ESTOQUE A Dissolver 34,0 g de fosfato monobásico de potássio (KH 2 PO 4 ) p.a em 500 ml de água destilada estéril. Ajustar o ph para 7,2 ( 0,1) com solução de hidróxido de sódio normal (NaOH 1 N) e completar o volume para ml com água destilada estéril. Colocar em frasco adequado e guardar em geladeira. 9.5 SOLUÇÃO ESTOQUE B Dissolver 81,1 g de cloreto de magnésio (MgCl 2.6H 2 O) p.a em água destilada estéril e completar o volume a ml. Colocar em frasco adequado e guardar em geladeira. 9.6 ÁGUA DE DILUIÇÃO FOSFATADA Pipetar 1,25 ml da solução estoque A e 5,0 ml da solução estoque B e diluir em água destilada, completando o volume a ml. Distribuir em frascos de diluição quantidades que assegurem, após esterilização em autoclave a 121 ºC durante 20 minutos, volume de 90 ( 2) ml. 10 PROCEDIMENTO DO MÉTODO 10.1 Antes de iniciar o trabalho, desinfetar as bancadas com desinfetante que não deixe resíduo Preparar as placas de Petri em duplicatas para cada alíquota de amostra a ser inoculada e proceder as suas identificações com o número dado pelo laboratório Homogeneizar a amostra, agitando vigorosamente o frasco, no mínimo 25 vezes Preparar diluições da amostra em água de diluição fosfatada Com pipeta esterilizada de 1 ml e com os cuidados de assepsia, transferir 1 ml da amostra e das diluições, em duplicata para as placas de Petri correspondentes Após inoculação e em espaço de tempo inferior a 20 minutos, entreabrir cada placa e acrescentar 15 ml do agar citrato férrico amoniacal, previamente fundido e estabilizado em banho-maria a 45 ( 1) ºC, tendo o cuidado de flambar a boca do tubo antes de verter o meio às placas.

5 10.7 Homogeneizar o inóculo com o meio contido na placa, com movimentos circulares moderados, para evitar a projeção do conteúdo para fora da placa Após a solidificação do meio, incubar as placas em posição invertida, a 20 ºC durante 20 dias Após o período de incubação, selecionar duas placas correspondentes à mesma diluição que tenham entre 30 e 300 colônias com coloração ferruginosa e efetuar a contagem com o auxílio de um contador de colônia tipo Quebec. 11 RESULTADO 11.1 Calcular a média aritmética das contagens obtidas nas placas em duplicata selecionadas e multiplicar o resultado pela diluição utilizada nessas placas Expressar o resultado em número de colônias de bactérias que precipitam o ferro por 1 ml da amostra original. 12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 12.1 AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of water and wastewater - 16th ed. Washington D.C., STARKEY, R.L. - Transformation of iron by bacteria in Bater. J.Am. Water Works Assoc , 1945.