Mestrado em Supervisão Pedagógica do Ensino das Ciências

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1 Mestrado em Supervisão Pedagógica do Ensino das Ciências Ano lectivo de 2005/2006 Protocolos das aulas práticas Rui Oliveira Braga, 2006

2 Formação de coacervados e vesículas Formação de coacervados Introdução Sob determinadas condições, proteínas, hidratos de carbono e outros materiais em solução podem formar agregados irregulares delimitados por estruturas semelhantes a membranas. Estas estruturas possuem algumas das características das células vivas, sendo designadas coacervados. Devido a estas características, é possível que estas estruturas representem estados intermédios na formação das primeiras células vivas na Terra. Nesta actividade, serão produzidos coacervados, estudadas as condições propícias à sua formação e observar algumas das suas características semelhantes a seres vivos. Microscópio, lâminas e lamelas Suporte para tubos de ensaio e tubos de ensaio Conta-gotas HCl 0,1M Papel indicador de ph Copo de 100ml Mistura de gelatina e goma arábica (5 partes de gelatina 1% e 3 partes de goma arábica 1%) Transferir um pouco da mistura de gelatina e goma arábica para um tubo de ensaio até metade do seu volume. Anotar o aspecto da mistura. Transferir uma gota da mistura para papel indicador de ph e anotar o valor. Adicionar uma gota de HCl com um conta-gotas. Homogeneizar bem por inversão. Anotar o aspecto da mistura. Continuar a adicionar o ácido, gota a gota, até a mistura ficar com um aspecto turvo. Transferir uma gota para papel indicador de ph e anotar o respectivo valor. Transferir outra gota para uma lâmina de microscopia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio óptico, começando pela objectiva de menor ampliação. Identificar coacervados (ver exemplo na fig. 1) e desenhar alguns exemplares. Adicionar novamente, gota a gota, o ácido à mistura, homogeneizar, e observar o desaparecimento de turvação após a adição de cada gota. Quando isso acontecer, transferir uma gota da mistura para papel indicador de ph e anotar o respectivo valor. Fig. 1. Aspecto típico de coacervados sob observação em microscopia óptica. Formação de coacervados e vesículas - MSPEC 2005/2006 1

3 Formação de coacervados e vesículas Tabela I. Grelha de apontamento dos resultados. Gotas de ácido adicionadas ph da mistura Aspecto da mistura Representação dos coacervados (anotar ph e ampliação) Questões para discussão De que modo os materiais usados na experiência poderão ser comparados com os materiais presentes nos oceanos primitivos? Em que intervalo de valores de ph se formaram coacervados? Quando o HCl foi adicionado acima de uma determinada quantidade os coacervados desapareceram. O que é que deveria adicionar para fazer reaparecer os coacervados? Formação de vesículas de fosfolípidos Colocar numa lâmina de microscopia uma gota de solução de lecitina e uma gota de água com corante (sem que as gotas se contactem). Cobrir as duas gotas com uma lamela e observar periodicamente, ao microscópio, a zona de contacto formada entre as duas gotas. Desenhar as estruturas observadas. Cerca de 30min depois, aspirar a água corada, encostando papel ao bordo da lâmina correspondente à água. Colocar uma gota de água sem corante no bordo oposto e continuar a aspirar com o papel. Observar ao microscópio as vesículas com o interior corado e desenhar. Referências Evolution & the Nature of Science Institutes, USA ( Formação de coacervados e vesículas - MSPEC 2005/2006 2

4 Pesquisa de extremófilos Pesquisa de extremófilos Introdução Extremófilos são organismos capazes de viver em condições extremas para o padrão humano. Temperaturas acima de 55ºC, concentração de sal perto da saturação e ph inferior a 4 são alguns exemplos de condições extremas para humanos mas que são suportáveis ou mesmo óptimas para os extremófilos. Estes ambientes são comuns na Terra onde se podem detectar estes extremófilos que, de acordo com o ambiente são classificados em termófilos (suportam elevadas temperaturas), acidófilos (baixo ph) e halófilos (elevadas concentrações de sal). Ambientes extremos comuns são encontrados em regiões com actividade vulcânica como as fontes hidrotermais (temperatura e ph extremos), lagos de elevada salinidade ou charcos de água do mar que, sob o efeito do Sol ocorre evaporação de água (salinidade extrema) e também ambientes criados pela actividade humana como alimentos conservados em sal, fornos industriais, etc. As condições ambientais da Terra durante o desenvolvimento dos primeiros seres vivos podem ter sido bastante diferentes das actuais, incluindo possivelmente temperaturas elevadas e baixo ph devido a intensa actividade geológica. Por isso, desde cedo na evolução dos primeiros seres vivos, terá ocorrido adaptação de células a estas condições, dando origem aos primeiros seres extremófilos. Os extremófilos são actualmente alvo da atenção da investigação em biotecnologia uma vez que poderão ser usados (organismos ou as suas enzimas purificadas) em processos industriais que requerem condições extremas. A detecção de extremófilos pode ser feita em microhabitats que estão ao nosso alcance como alimentos processados por pasteurização, alimentos ácidos como o vinagre, pele em que o suor proporciona um ambiente salino e solo. Meio de cultura rico líquido (peptona 5g/l e extracto de carne 3g/l) Tubos de ensaio rolhados com rolha de algodão cardado Cotonetes esterilizadas Lamparinas Estufa a 55ºC NaCl Papel indicador de ph HCl 0,1M Amostras biológicas (fiambre, leite, vinagre e solo) Preparar um lote de meio rico, distribuir por tubos e esterilizar. Para pesquisa de halófilos, preparar o meio de cultura rico, adicionar NaCl para concentração final de 15% (p/v), distribuir por tubos de ensaio rolhados e esterilizar em autoclave. Para a detecção de acidófilos, preparar outro lote de meio de cultura rico com ph ajustado para 3 com adição de HCl, distribuir por tubos rolhados e esterilizar. Pesquisa de extremófilos - MSPEC 2005/2006 1

5 Pesquisa de extremófilos Inocular os meios de cultura com as diferentes amostras, usando cotonetes esterilizadas, de acordo com a seguinte tabela: Amostra Fiambre Leite Vinagre Pele Solo Meio de cultura Meio com NaCl Meio rico Meio ácido Meio com NaCl Todos os meios Incubar os meios com NaCl e ácido à temperatura ambiente durante 72h. Incubar o meio rico para pesquisa de termófilos em estufa a 55ºC durante 72ºC. Observar os tubos após incubação para a presença de microrganismos (aspecto turvo do líquido em oposição a aspecto límpido e transparente do meio esterilizado). Fazer coloração de Gram para confirmar a presença de bactérias e analisar a diversidade microbiana. Coloração de Gram Violeta de cristal (0,4%, p/v em álcool 70%, v/v) Solução iodada (complexo polivinilpirrolidona-iodo, 13% p/v, em KI, 1,9%, p/v) Solução álcool/acetona (3:1) Safranina (0,25% p/v em álcool etílico a 20%, v/v) Água desionizada Cotonetes esterilizados Lâminas e lamelas de microscopia Microscópio Óleo de imersão Transferir um pouco da cultura para uma lâmina de microscopia com uma cotonete Fixar o material, cortando a chama da lamparina com a lâmina umas 4 vezes, tendo cuidado para não deixar aquecer demasiado. Cobrir o material com violeta de cristal e deixar 1min Remover o excesso, lavando brevemente com água Sacudir a lâmina para retirar o excesso de água, cobrir com solução iodada e deixar 1min Pesquisa de extremófilos - MSPEC 2005/2006 2

6 Pesquisa de extremófilos Remover a solução iodada com água e aplicar a solução de álcool/acetona cuidadosamente até não se libertar mais corante violeta (não descorar demasiado a preparação). Lavar de seguida com água Sacudir o excesso de água e cobrir com safranina durante 1min. Lavar com água, remover o excesso de água cuidadosamente com papel absorvente e observar ao microscópio. Referências The Woodrow Wilson Foundation Leadership Program for Teachers, USA ( Pesquisa de extremófilos - MSPEC 2005/2006 3

7 MSPEC 2005/2006 Fotossíntese Fotossíntese Introdução Com a utilização da energia solar directamente para a produção de hidratos de carbono, que servirão posteriormente como blocos na síntese de materiais estruturais, precursores metabólicos de outras biomoléculas e de fonte de energia, os primeiros seres vivos iniciaram uma alteração drástica nas condições ambientais do planeta. No planeta, o oxigénio estaria na sua totalidade combinado quimicamente. Assim, na atmosfera não estaria presente o oxigénio molecular. Com a actividade fotossintética continuada, o oxigénio foi-se acumulando na atmosfera, sendo esta a origem de todo o oxigénio gasoso que se encontra actualmente. Como agente químico, o oxigénio é um veneno, actuando como oxidante forte da matéria orgânica. A adaptação dos seres vivos a estas condições envolveu a utilização da capacidade oxidante para extracção de energia para os processos metabólicos (respiração aeróbia) e mecanismos moleculares de protecção antioxidante. Nesta actividade prática pretende-se ilustrar a formação de um produto secundário da actividade fotossintética, o oxigénio, mas central na ecologia à escala global. Para isso, proceder-se-á à observação da libertação de oxigénio e sua medição sob a influência de intensidades diferentes de luz. Fotossíntese Proveta de 250ml Seringas de 1ml Parafilm Mola Tesoura 400ml de hidrogenocarbonato de sódio (1%, p/v) Elodea ou Cabomba Mergulhar a planta na solução de hidrogenocarbonato de sódio na proveta. Com a planta completamente imersa, cortar um pedaço do seu caule e manter dentro do líquido Encher completamente uma seringa de 1ml, tapada na extremidade com parafilm, com solução de hidrogenocarbonato de sódio. Colocar a seringa invertida dentro da proveta com a extremidade cortada da planta dentro e sem deixar entrar ar Fazer incidir luz na planta e medir a quantidade de oxigénio produzido por unidade de tempo (taxa de produção de O2 em ml/h). Medir as taxas em condições de intensidade de luz diferente Questão para discussão Se repetir a experiência na ausência de luz, qual será a taxa de produção de oxigénio? É sabido que a fotossíntese requer consumo do gás CO2. Como é que, neste caso, a alga tem acesso a este gás? Fotossíntese - MSPEC 2005/2006 1

8 Fotossíntese Referências Scottish Schools Equipment Research Centre, [14/6/06] Fotossíntese - MSPEC 2005/2006 2

9 Ciclo de vida de leveduras Ciclo de vida de leveduras Introdução A levedura Saccharomyces cerevisiae é um dos seres eucarióticos mais simples. É unicelular com um ciclo de vida diplobionte (fig. 1). Há reprodução vegetativa por mitoses durante cada uma das fases (haplóide e diplóide). O início da fase haplóide ocorre com a meiose de uma céliula diplóide, resultando uma estrutura (asco) contendo 4 produtos da meiose haplóides (ascósporos). O início da fase diplóide dá-se com a conjugação de duas células haplóides e formação de uma célula diplóide que prolifera vegetativamente. A conjugação em levedura ocorre entre células de tipo sexual diferente, designados a e α. Neste processo não se classificam as células que conjugam em sexos feminino e masculino, uma vez que não há distinção sexual verdadeira entre elas: não há cromossomas sexuais em S. cerevisiae e não há diferenciação morfológica. Fig. 1. Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae. Na Terra primitiva, a evolução da forma de reprodução terá partido de um processo assexuado por divisão binária para um processo sexuado com fusão de células e respectivos núcleos. Neste processo originaram-se as primeiras células diplóides que, por divisão reducional do número de cromossomas originaram células haplóides capazes de procederem a fusão sem que o número de cromossomas se altere para a geração seguinte. A levedura S. cerevisiae é um organismo modelo na investigação biológica por muitos dos processos bioquímicos e moleculares serem semelhantes ao ser humano, para além do interesse biotecnológico e simplicidade de manipulação laboratorial. O seu modo de reprodução pode ser considerado um processo sexuado primitivo por não haver distinção sexual verdadeira entre as células haplóides que se fundem. Por isso, é um bom modelo também para perceber o surgimento da reprodução sexuada. Conjugação de leveduras Placas com meio de cultura YPDA (extracto de levedura 0,5%, p/v; peptona 2g/l, p/v; glucose 2%, p/v; agar 2%, p/v) Palitos esterilizados Microscópio, lâminas e lamelas Lamparinas Estufa a 30ºC Saccharomyces cerevisiae (2 estirpes haplóides de tipo sexual a e α) em cultura em meio YPDA Ciclo de vida de leveduras - MSPEC 2005/2006 1

10 Ciclo de vida de leveduras Com um palito esterilizado, transferir células do tipo sexual a para uma placa de YPDA nova. Proceder de igual modo para o tipo sexual α com novo palito, de acordo com o esquema da figura 2. Misturar as duas estirpes no centro da placa (fig. 2), transferindo a células com palitos esterilizados a a +!! Fig. 2. Representação esquemática dos inóculos a realizar para a conjugação. Incubar a 30ºC durante 2h Fazer uma preparação da mistura de células entre lâmina e lamela e observar ao microscópio para identificar os zigotos (fig. 3) B A C Fig. 3. Células observáveis em culturas de S. cerevisiae com conjugação: A, célula vegetativa em gemulação; B e C, conjugação de células com tubo de conjugação a fazer a união. Por vezes observa-se uma pequena gémula no tubo de conjugação (C). Proceder a controles fazendo a observação microscópica das células exclusivamente a e das exclusivamente α (confirmar ausência de zigotos) Questão para discussão Explique o mecanismo de reconhecimento do tipo sexual para conjugação com base na secreção de feromonas. Esporulação de leveduras Meio YPDA (extracto de levedura 0,5%, p/v; peptona 2g/l, p/v; glucose 2%, p/v; agar 2%, p/v) e YAA (extracto de levedura 0,25%, p/v; acetato de potássio 1%, p/v; agar, 2%, p/v) Palitos esterilizados Estufa a 30ºC Lamparinas Microscópio, lâminas e lamelas Ciclo de vida de leveduras - MSPEC 2005/2006 2

11 Ciclo de vida de leveduras Estirpe diplóide de S. cerevisiae Inocular meio YPDA com a estirpe diplóide ou a partir da mistura de conjugação do protocolo anterior e incubar 1-2 dias a 30ºC Transferir para meio YAA e incubar a 30ºC 3-5 dias Fazer uma preparação da cultura entre lâmina e lamela e observar ao microscópio os ascos contendo, cada um, 4 ascósporos (fig. 4) Questões para discussão Fig. 4. Exemplos da morfologia típica de ascos de S. cerevisiae. Apresente uma explicação para a indução de meiose em leveduras com base na composição dos meios de cultura usados na transferência de células. Dos quatro ascósporos de cada asco, refira quantos são do tipo sexual a e α. Referências Council on Undergraduate Research, [27/3/06] The Gene Project, [19/8/05] [24/8/06] Ciclo de vida de leveduras - MSPEC 2005/2006 3