BIOENSAIOS COM ORGANISMOS AQUÁTICOS... Ecotoxicologia Ana Morbey - 16/06/04 Instituto do Ambiente

Transcrição

1 Bioensaios

2 COM ORGANISMOS AQUÁTICOS... 2

3 ORGANISMOS-TESTE Vibrio fischeri (bactéria) Daphnia magna (microcrustáceo) Thamnocephalus platyurus (microcrustáceo) Artemia franciscana (no caso de amostras salinas) Pseukircheneriella subcapitata (alga) Lemna minor (macrófita) 3

4 MATRIZ: ÁGUA ELUATOS (Resíduos Sólidos) 4

5 TIPO DE AMOSTRAS Efluentes industriais Água para consumo Águas superficiais ETAR s 5

6 MICROTOX Vibrio fischeri 6

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9 Fotómetro: Mede a quantidade de luz emitida pelas bactérias em unidades relativas de luz bem como a diminuição ou aumento da mesma na presença de uma amostra. O aparelho deve estar calibrado para realizar leituras no comprimento de onda de 492 nm 9

10 Princípio do Método: Medição da percentagem de inibição da luminescência de uma suspensão de bactérias marinhas da espécie Vibrio fischeri quando em presença de substâncias tóxicas Condições de realização: Temperatura: 15º ± 1ºC Salinidade: 2% de NaCl 10

11 Organismo de ensaio: Bactéria salina Vibrio fischeri (estirpe NRRL-B ) preparada a partir de reagentes liofilizados 11

12 PRÉ-TRATAMENTO DA AMOSTRA Ph: O valor deste parâmetro deve situar-se no intervalo de 6,3-7,8; Cor: Em amostras muito coradas deve-se efectuar procedimento específico para correcção do valor de toxicidade calculado inicialmente; Salinidade: Para amostras não salinas torna-se necessário fazer o ajustamento osmótico da mesma; Turvação: Para amostras com turvação, deve-se sedimentar 1 h ou centrifugar 10 m a 5000 g 12

13 DESCRIÇÃO DO MÉTODO REACTIVAÇÃO DAS BACTÉRIAS PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES DE ENSAIO PREPARAÇÃO DAS SUSPENSÕES DE ENSAIO Soluções de ensaio Suspensões de ensaio A B Cuvete de leitura Cuvete de reconstituição 13

14 DESCRIÇÃO DO MÉTODO LEITURA DOS VALORES NO TEMPO 0 ADIÇÃO DA AMOSTRA ÀS SUSPENSÕES DE ENSAIO LEITURA DOS VALORES NO TEMPO 5, 15,... Soluções de ensaio Suspensões de ensaio A B Cuvete de leitura Cuvete de reconstituição 14

15 VALIDAÇÃO DO MÉTODO Utilização de soluções de referência - Fenol (5 mn) - Sulfato de Zinco (15 mn) A CE50 destas amostras deve situar-se dentro de uma gama de mg/l para o Fenol e 3-10 mg/l para o ZnSO4 15

16 CARTA DE CONTROLO 35,00 VALORES DE CE 50 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0, Nº DE AMOSTRAS Valores Média LSC LIC Lim. máx. Firma Lim. min. Firma 16

17 Ensaio de inibição da mobilidade de Daphnia magna 17

18 Daphnia magna - Microcrustáceo filtrador -Habitat: em massas de água doce -Ciclo de vida: Maior parte do ano partenogénese Inverno reprodução sexuada ovos resistentes - ephippias 18

19 DAPHTOXKIT OU Protocolo de acordo com a Norma ISO 6342:

20 DESCRIÇÃO DO MÉTODO -Ovos dormentes (ephippia) ou juvenis de Daphnia magna KIT - incubação - 72 horas (6000 Lux, 21ºC) -Série de diluições da amostra KIT - Preenchimento da placa teste 20

21 DESCRIÇÃO DO MÉTODO -Transferência das dáfnias para a placa ou tubos de ensaio -Incubação: KIT (sem luz) e Norma ISSO (16h de luz e 8h de escuro) 21

22 DESCRIÇÃO DO MÉTODO (Cont.) -Leituras às 24 e 48 horas para contagem dos organismos imobilizados -Determinação do valor de CE50 (concentração responsável pela imobilização de 50% dos organismos) 22

23 X A B C D 23

24 VALIDAÇÃO DO MÉTODO A percentagem do valor médio de imobilização dos controlos for menor ou igual a 10% A CE50 24h e CE50 48 h, do dicromato de potássio (sol. De referência) se situar no intervalo indicado pela firma para cada lote de organismos 24

25 BIOENSAIO THAMNOTOXKIT Thamnocephalus platyurus 25

26 BIOENSAIO 26

27 BIOENSAIO DESCRIÇÃO DO MÉTODO -Quistos de Thamnocephalus platyurus -Incubação - 24 horas ( Lux, 25ºC) -Série de diluições da amostra -Preenchimento da placa teste -Transferência dos organismos para a placa -Incubação (sem luz) 27

28 BIOENSAIO DESCRIÇÃO DO MÉTODO (Cont.) -Leituras às 24 para contagem dos organismos mortos -Determinação do valor de CE50 (concentração responsável pela imobilização de 50% dos organismos) 28

29 VALIDAÇÃO DO MÉTODO A percentagem do valor médio de imobilização dos controlos for menor ou igual a 10% A CE50 24h e CE50 48 h, do dicromato de potássio (sol. De referência) se situar no intervalo indicado pela firma para cada lote de organismos 29

30 Ensaio de inibição do crescimento da microalga Pseudokirchneriella subcapitata 30

31 Pseudokirchneriella subcapitata - Microalga unicelular -Clorophyta - Habitat: em massas de água doce -1 pérola tem cerca de um milhão de células - Abundante em ambientes ricos em nutrientes 31

32 ALGALTOXKIT 32

33 33

34 PRÉ-TRATAMENTO DA AMOSTRA -Correcção da cor -Eliminação da turvação por filtração 34

35 DESCRIÇÃO DO MÉTODO -Desagregação das pérolas de Pseudokirchneriella subcapitata -Série de diluições da amostra -Adição da alga (1x10 6 células/ml) em 100ml obtendo-se uma concentração final de 1x10 4 células/ml -Preenchimento das cuvetes (25 ml) - 35

36 DESCRIÇÃO DO MÉTODO -Incubação - 72 horas ( Lux, 25ºC) -Leitura das absorvâncias no espectofotómetro às 0, 24, 48 e 72 h NOTA:Quanto menor for o valor da absorvância maior a quantidade de células mortas de alga 36

37 VALIDAÇÃO DO MÉTODO Utilização de solução de referência Dicromato de Potássio CE50 72 horas 0,54 mg/l (0,43 0,65 mg/l) O número de células de alga no controlo deve aumentar, no mínimo, 16 vezes 37

38 PROBLEMAS QUE PODEM OCORRER DURANTE O TESTE Problemas que interferem nas leituras no espectrofotómetro Turvação Precipitação Floculação 38

39 SOLUÇÕES Alteração do método de leitura Efectuar uma primeira leitura sem agitar a cuvete e uma segunda leitura após agitação para ressuspensão da alga O valor final do nº de algas resulta da subtracção do valor da absorvância da 1ª leitura à 2ª leitura 39

40 Ensaio de inibição do crescimento da macrófita Lemna minor 40

41 Lemna minor - Macrófita aquática flutuante - Habitat: em massas de água doce - Reprodução vegetativa dando uma fronde origem a duas 41

42 DESCRIÇÃO DO MÉTODO -Plantas de Lemna minor em cultura (meio sólido) conservada no frigorífico (±6ºC) -Série de diluições da amostra (100 ml) -Preenchimento dos cristalizadores -Transferência dos organismos para os cristalizadores (10 frondes por cristalizador) -Incubação -168 horas ( Lux, 24ºC) 42

43 DESCRIÇÃO DO MÉTODO (Cont.) -Leituras às 0, 72, 120 e 168 h para contagem do nº de folhas e medição da área foliar utilizando um Software específico 43

44 Cultura em meio sólido Repicagem para o meio líquido 44

45 Preenchimento dos cristalizadores BIOENSAIOS 45

46 Incubação na estufa 46

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49 Variação da área foliar ao longo do período do teste 49

50 VALIDAÇÃO DO MÉTODO Utilização de solução de referência 3,5 - Diclorofenol CE horas 2,7 mg/l (1,8 3,6 mg/l) A taxa de crescimento do control para o nº de frondes deve ser superior a 0,275/dia A variação do ph do control não deve ser superior a 1,5 unidades 50

51 VANTAGENS DO MÉTODO A amostra pode apresentar cor, turvação, precipitação e até consistência O método pode ser utilizado em sedimentos como um teste de contacto directo 51

52 ARTOXKIT Artemia franciscana 52

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54 DESCRIÇÃO DO MÉTODO -Quistos de Artemia franciscana -Incubação - 24 horas ( Lux, 25ºC) -Série de diluições da amostra -Preenchimento da placa teste -Transferência dos organismos para a placa -Incubação (sem luz) 54

55 DESCRIÇÃO DO MÉTODO (Cont.) -Leituras às 24 e 48 horas para contagem dos organismos mortos -Determinação do valor de CE50 (concentração responsável pela imobilização de 50% dos organismos) 55

56 VALIDAÇÃO DO MÉTODO Utilização de solução de referência Dicromato de Potássio CE50 24 horas 31,0 mg/l (22,0 40,0 mg/l) CE50 48 horas 8,0 mg/l (5,5 10,5 mg/l) 56

57 TRATAMENTO DOS DADOS Cálculo da percentagem de imobilidade/mortalidade (Nºde mortos(imóveis)/total de organismos) Cálculo do CE/CL50 (Gráfico logarítmico) ou utilizando software específico 57

58 INTERPRETAÇÃO E TRATAMENTO A B DOS RESULTADOS C 58