Fluxograma de isolamento e identificação de C. jejuni e C. coli a partir de alimentos. Alimento (25 g)

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1 Fluxograma de isolamento e identificação de C. jejuni e C. coli a partir de alimentos Alimento (25 g) Caldo de Enriquecimento Seletivo (100 ml) Microaerofilia 42ºC / 48 h Ágar Seletivo para Campylobacter Microaerofilia 42ºC / 48 h Suspeita de Campylobacter Identificação Presuntiva Exame a fresco (contraste de fase) Exame de esfregaço corado Identificação Definitiva Fermentação de glicose Produção de catalase Produção de oxidase Redução de nitrato Produção de H 2 S Crescimento a: 25ºC 35ºC Crescimento em glicina 1% Crescimento em NaCl 3,5% Sensibilidade: ácido nalidíxico (30 μg) cefalotina (30 μg) Biotipagem Hidrólise do hipurato Produção rápida de H 2 S Hidrólise de DNA

2 Suspeita de Campylobacter Colônias características: lisas, translúcidas, convexas, incolores ou acinzentadas e espalhadas (depende do ágar seletivo utilizado) Identificação Presuntiva Exame a fresco (contraste de fase): observar o movimento de saca-rôlhas Exame de esfregaço corado: visualização da forma típica asa de gaivota Identificação Definitiva Utilização de glicose: negativa (desenvolvimento de coloração rósea escura em contraste com a coloração vermelha salmão do meio de cultura) Produção de catalase: positiva Produção de oxidase:positiva Redução de nitrato: positiva Produção de H 2 S: positiva Crescimento a: 25ºC: negativa Crescimento a 35ºC: positiva Crescimento em glicina 1%: positiva Crescimento em NaCl 3,5%: negativa Sensibilidade: ácido nalidíxico (30 μg): Sensível Sensibilidade a cefalotina (30 μg): Resistente Biotipagem Hidrólise do hipurato: C. jejuni (+)*, C. coli (-) Produção rápida de H 2 S Hidrólise de DNA * cepas de C. jejuni hipurato negativas tem sido relatadas.

3 Compendium, 2001 Testes de identificação bioquímica Selecionar uma colônia do meio de isolamento primário Plaquear em Ágar BHI + 5% sangue desfibrinado carneiro Incubar em microaerofilia a 42ºC / 24 h (em geral) Transferir a cultura para 5 ml de Caldo BHI (ajustar para escala de McFarland nº 1) Usar a suspensão de células em BHI para inocular tubos e placas de meios para testes bioquímicos e de crescimento Inocular tubos de base de fermentação de glicose, nitrato, glicina, NaCl, cisteína e ágar BHI inclinado com 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) de suspensão celular usando uma pipeta Pasteur. Colocar uma tira de papel impregnado no tubo contendo meio cisteína para detecção de H 2 S. Incubar os tubos em microaerofilia de 35ºC a 37ºC durante 3 dias com as tampas com ¾ da volta. Inocular 2 placas de Ágar BHI + 5% de sangue desfibrinado de carneiro, para testar para crescimento a 25ºC e a 42ºC, pela saturação de swab de algodão com a suspensão em caldo e fazendo um única estria através de cada placa. Incubar as placas em microaerofilia em cada temperatura por 3 dias. Inocular a superfície toda do Ágar BHI + 5% de sangue desfibrinado de carneiro, com um swab umedecido com a suspensão bacteriana. Colocar os discos de ácido nalidíxico e de cefalotina sobre a placa e incubar em microaerofilia a 35 37ºC, até que zonas de inibição de crescimento ao redor do disco possam ser medidos, geralmente dentro de 24 h. Inocular os restantes dos tubos dos meios, TSI, base O-F com e sem glicose, e TMAO, com uma agulha de inoculação, com pequena quantidade de crescimento a partir do Ágar BHI + 5% de sangue desfibrinado de carneiro. Semear com inóculo pesado em TSI (uma vez). Inocular nos meios O-F e TMAO 3 vezes no 1/3 superior do meio. Incluir no teste TMAO um tubo do meio inoculado com uma cepa de C. lari (controle positivo) e um tubo não inoculado do meio. Incubar os tubos de TSI e O-F em microaerofilia a 35-37ºC por 3 dias com as tampas com ¾ da volta. Incubar tubos TMAO numa atmosfera anaeróbica por 7 dias, com as tampas com ¾ da volta.

4 Meios de cultura Caldo de enriquecimento seletivo (Compendium, 2001): Bolton Park and Sanders Hunt Compendium, 1984: VTP Caldo Brucella-FBP: Caldo Brucella a...29,0 g Mistura de antibióticos b...10,0 ml Solução de FBP c...30,0 ml Água destilada...960,0 ml a pode ser substituído por: 30g de Caldo-soja-tríptica + 2g de extrato de levedura + 1g de citrato de sódio (por litro). b mistura de antibióticos, acrescentar ao caldo no momento do uso (VTP = vancomicina: 10 mg; trimetoprima: 5 mg; polimixina 250 μg) c solução de FBP: 0,25 g de sulfato ferroso (FeSO 4.7H 2 O) + 0,25 g de metabissulfito de sódio anidro + 0,25 g de piruvato de sódio anidro + 30 ml de água destilada. Após a dissolução, filtrar a solução através de membrana filtrante de 0,22 μm de porosidade. Acrescentar ao caldo no momento do uso. Ágar seletivo para Campylobacter (Compendium, 2001): - Ágar base seletivo sem sangue Campylobacter (CCDA-Preston modificado) + suplemento seletivo CCDA (cefoperazona, anfotericina B). - Ágar Campy-Cefex - Ágar Campy-Line Compendium, 1992: Ágar seletivo para Campylobacter seg. Skirrow (Merck): Ágar Seletivo para Campylobacter (Base) + Suplemento seletivo para Campylobacter (vancomicina 2,0 g; polimixina 50,0 μg; trimetoprima 1,0 mg) Ágar Campylobacter (Blaser-Wang) [Oxoid]: Meio Base =>Ágar base Columbia (ou Ágar Sangue) + suplemento seletivo Campylobacter* (vancomicina 10 mg; trimetoprima 5 mg; cefalotina 15 mg; anfotericina B 2 mg; polimixina B U.I./litro) % de sangue desfibrinado de carneiro ou 5-7% de sangue lisado de cavalo. * mistura liofilizada disponível no mercado Campilofar produzida pela CEFAR Diagnóstica Ltda.

5 Atmosfera de microaerofilia Geradores de gás comerciais: Anaerocult C (Merck) GasPaK: utilizado sem o catalisador Probac CampyGen (Oxoid): atenção: existem envelopes para jarras de 2,5 e 3,5 litros Jarras de anaerobiose 1 jarra com capacidade de 8 litros (para incubação de caldo de enriquecimento) De preferência, mais 1 jarra com capacidade de 8 litros (para incubação de placas). Ou de 2,5 litros (neste caso, mais de uma, 3 ou 4). Reagentes de identificação bioquímica Peróxido de hidrogênio a 3% (para teste de catalase) Teste de redução de nitrato: Solução A: Ácido sulfanílico...2,0 g Ácido acético glacial...60,0 ml Água destilada...150,0 ml Solução B: Alfa-naftol...1,0 g Álcool absoluto...200,0 ml Teste de oxidase: Tetrametilparafenilenodiamina.2HCl...0,25 g Água destilada...200,0 ml ou Spot test oxidase reagent (já pronto) Teste de hidrólise de hipurato: Solução de hipurato de sódio: Hipurato de sódio...1,25 g Água destilada...50,0 ml Dissolver o hipurato de sódio e filtrar através da membrana filtrante de 0,2 μm de porosidade. Distribuir alíquotas de 0,4 ml em tubos de 13 com tampa rosqueada. Conservar a 20ºC, até o momento do uso. Solução de ninhidrina: Ninhidrina...1,5 g Acetona...25,0 ml Etanol...25,0 ml Preparar a solução no momento do uso. Discos de antibióticos:

6 Cefalotina (30 μg) Ácido nalidíxico (30 μg) CEFAR Fármaco Diagnóstica Ltda Teste de catalase Cultura de 24 48h de C. jejuni em Ágar BHI inclinado. Peróxido de hidrogênio a 3%. Teste de oxidase Redução de nitrato Caldo nitrato (para Campylobacter) BHI...25,0g Nitrato de potássio...2,0g Água destilada...1,0 L Dissolver o BHI e nitrato de potássio na água destilada, e ajustar o ph para 7,0. Distribuir 4,0 ml do meio em tubos de 15 x 125 mm com tubinhos de Durhan invertidos e autoclavar a 121ºC por 15 minutos. Para cultura em caldo nitrato de 3 dias, adicionar 5 gotas de pipeta Pasteur de solução A (ácido acético e ácido sulfanílico (5N)) e 5 gotas de pipeta Pasteur de solução B (alfa-naftol em ácido acético (5N)). Zinco em pó. Utilização da glicose Meio de oxidação-fermentação (O-F) para Campylobacter: - Meio base sem carboidrato: Bacto-casitone...0,2 g Ágar...0,3 g Vermelho fenol, aquoso 1,0%...0,3 ml Água destilada...100,0 ml Dissolver o casitone em água destilada e acrescentar o vermelho fenol. Ajustar o ph para 7,4, acrescentar o ágar, e aquecer até a fervura por 1 min. para dissolver completamente. Autoclavar a 121ºC por 15 min. e distribuir 6 ml do meio base em tubos de 15 x 125 mm, com tampa rosqueada.deixar os tubos em pé. - Meio base com carboidrato Carboidrato (glicose) concentração final 1%: Glicose 10% em água destilada*...10,0 ml * Esterilizar através da membrana filtrante (0,22 μm de porosidade). Quando o meio base esterilizado estiver esfriado, acrescentar o carboidrato com assepsia (10 ml de carboidrato a 10% a 100 ml do meio base e distribuir. Base de fermentação para Campylobacter Base fermentação Entérica (Difco)...18,0 g

7 Indicador de Andrade...10,0 ml Glicose...10,0 g Água destilada...1,0 L Dissolver a base de fermentação entérica e glicose em 950,0 ml de água destilada. Adicione o indicador de Andrade, e ajustar o ph para 7,2. Adicionar água destilada para completar o volume de 1000,0 ml, e distribuir 3,0 ml em tubos de 15 x 125 mm com tubinhos invertidos. Autoclavar a 121ºC por 15 min. Fermentação é indicada por uma coloração vermelha (produção de ácido) em caldo de fermentação com indicador de Andrade. Oxidação é indicada por uma coloração amarela (produção de ácido) no meio O-F com indicador vermelho fenol. O meio O-F ficará amarelo (ácido) quando removido da atmosfera microaeróbica devido a absorção de CO 2. Para ler os tubos, deixe-os na atmosfera ambiente até que o meio O-F controle se torne neutro ou alcalino, geralmente em 1 a 2 horas. Inocular 2 tubos de meio O-F, 3 vezes em cada tubo a partir do ágar sangue. Um tubo contém glicose e outro só base. Incubar 4 dias sob atmosfera microaeróbica a 35-37ºC. Campylobacter não utiliza glicose ou outros açúcares e não mostra nenhuma mudança em nenhum dos tubos. Hidrólise do hipurato Preparar solução de hipurato de sódio a 1% em água destilada estéril, distribuir 0,4 ml em tubos de 13 x 100 mm, com tampa rosqueada, e congelar a 20ºC até o momento do uso. Emulsificar num tubo descongelado de hipurato de sódio uma alçada de crescimento de 18 a 24h em placa de Ágar BHI + 5% de sangue desfibrinado de carneiro. Incubar a suspensão num banho-maria a 37ºC por 2h. Após a incubação, adicionar 0,2 ml de solução de ninhidrina a 3,5%, numa mistura 1:1 de acetona e butanol. (Conserve a solução de ninhidrina no escuro em temperatura ambiente.) Re-incubar o tubo no banho-maria a 37ºC por 10 minutos. desenvolvimento de uma cor de cristal violeta é um resultado positivo. Incolor ou púrpura clara é considerado negativo. Tolerância à temperatura Crescimento em placa de Ágar BHI + 5% de sangue desfibrinado de carneiro a 35ºC e a 42ºC. Não cresce a 25ºC. Discos antimicrobianos Característica C. jejuni C. jejuni subsp. doylei C. coli C. lari Resistência ao ácido S* S S R nalidíxico Resistência a cefalotina R R R R * C. jejuni resistentes ao ácido nalidíxico tem sido relatados. S= sensível; R=resistente.

8 Além destes testes, o Compendium, 2001 e BAM, 2001, preconizam os seguintes testes: Produção de H 2 S detecção por tira de papel de acetato de chumbo Tolerância a glicina a 1% e NaCl a 3,5% TMAO ( N-óxido de trimetilamina) Compendium, 2001 Para diferenciar do C. lari. Referências bibliográficas: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods Fourth edition Edited by Frances Pouch Downes, Keith Ito American Public Health Association, Bacteriological Analytical Manual Online March 2001 chapter 7 Campylobacter, disponível no site

9 Relação de meios de cultura e reagentes: - Deixar preparadas as amostras: pesar 25g de carne de frango cru em bolsa plástica de 500 ml de capacidade. Conservar na geladeira até o início da aula prática. Quantidade: no mínimo 2. - Caldo de enriquecimento seletivo para Campylobacter: 100 ml/ erlenmeyer de 250 ~300 ml de capacidade. Quantidade: no mínimo 2 frascos. - Microscópio de contraste de fase ou de campo escuro. - Lâminas e lamínulas - Solução fisiológica - Cristal violeta (Gram) - Ágar BHI + 5% de sangue desfibrinado de carneiro. Quantidade: 20 placas. - Caldo BHI. Quantidade: 10 tubos. - Ágar BHI inclinado. Quantidade: 20 tubos. - Meio base O-F com glicose. Quantidade: 30 tubos de Meio base O-F sem glicose. Quantidade: 30 tubos de Meio base de fermentação para Campylobacter. Quantidade: 20 tubos de Peróxido de hidrogênio a 3%. - Caldo nitrato para Campylobacter. - Reagentes para redução de nitrato: solução A e B. - Reagente para oxidase. - Discos de antibióticos: cefalotina (30 μg) e ácido nalidíxico (30 μg). - Solução de hipurato de sódio (0,4 ml/tubo de 12 com tampa rosqueada). - Solução de ninhidrina (preparar no dia do uso).