Ano 2017 / Versão 7 MANUAL DE MICROBIOLOGIA

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1 Ano 2017 / Versão 7 MANUAL DE MICROBIOLOGIA

2 SUMÁRIO 1 - Avaliação da qualidade microbiológica da água Técnica de membrana filtrante Procedimento Bactérias Heterotróficas Clostridium perfringens E.coli / Coliformes totais Enterococos Pseudomonas aeruginosa Confirmação da Pseudomonas aeruginosa em Ágar Leite Tempo de incubação das placas Amostragem por Swab Amostragem do ar Descarte de placas contaminadas

3 1- INTRODUÇÃO A água contém uma série de microorganismos, alguns naturais do ecossistema aquático e outros, microorganismos transitórios, provenientes do solo e de dejetos industriais e domésticos. O controle dessa população bacteriana é de fundamental importância, visto que densidades elevadas de microorganismos na água podem determinar a deterioração de sua qualidade, com desenvolvimento de odores e sabores desagradáveis e produção de biofilmes. Além disso, quantidades elevadas de bactérias podem apresentar risco à saúde dos consumidores, pois algumas delas podem atuar como patógenos oportunistas, especialmente problemáticas para indivíduos debilitados imunologicamente. 2 - TÉCNICA DE MEMBRANA FILTRANTE A técnica de membrana filtrante é um método rápido e preciso para isolamento e identificação de colônias de bactérias. Esta técnica é recomendada pelo Standart of Methods for the Examination of Water and Wasterwater, referência internacional em análises em águas. Esta técnica consiste em filtrar a vácuo 100 ml da amostra através de uma membrana filtrante (com porosidade controlada de 0,45 µm), onde ficarão retidas células de possíveis bactérias contaminantes. Depois, coloca-se assepticamente, a membrana sobre um meio de cultura seletivo para detecção do grupo específico de microorganismos indicadores, contido em placa de Petri. Terminado este passo, incuba-se as placas de Petri à temperaturas adequadas ao desenvolvimento dos microorganismos. 2

4 3 PROCEDIMENTO Antes de começar as análises, esterilize a capela com álcool 70% e ligue a lâmpada germicida por 10 minutos. Obs: Desligar a lâmpada germicida antes do início das análises. Se estiver ligada, a lâmpada germicida esterilizará sua amostra e poderá ocasionar danos à saúde se ficar exposto por longos períodos. Etapas: 1 Colocar membrana de 47mm no funil de filtração; 2 Inserir 100 ml de amostra a ser analisada no funil de filtração, e ligue a bomba a vácuo (até que toda os 100 ml passe pela membrana). 3 Remover assepticamente a membrana do funil de filtração, com auxílio de uma pinça e colocá-la sobre a superfície da placa contendo o Agar desejado. Obs: antes de usar a pinça, esteriliza-la com álcool e flambando na chama. 4 Incubar a placa a ser analisada invertendo-a. Observações: Antes do início de trabalho, o funil deve estar autoclavado, bem como o frasco de coleta de amostra; Rinsar (limpar) o funil de filtração com 100 a 200 ml de água destilada e autoclavada após a troca de amostra a ser filtrada; Abaixo, encontram-se fotos exemplificando os passos: 3

5 OBS: Após as filtrações deve-se tomar cuidado para que a água não ultrapasse a saída do Kitazato (conexão com a bomba), para evitar que a entrada de água na bomba não danifique a mesma Bactérias Heterotróficas Apesar de ser virtualmente impossível a determinação de todas as bactérias presentes em uma água, a determinação de bactérias heterotróficas é de fundamental importância, seja em água bruta, tratada ou mineral. A determinação de bactérias heterotróficas tem sido usada como indicador da qualidade higiênico-sanitária dos alimentos e águas. A presença destes microorganismos em grande número indica matéria-prima (embalagens), excessivamente contaminada, limpeza e desinfecção inadequadas de maquinários e higiene insuficiente na produção, além do elevado número impedir a detecção de coliformes. Não há na legislação um valor máximo permitido para a quantidade de bactérias heterotróficas (RDC nº275 Águas Minerais), mas é de extrema importância a determinação da densidade delas, pois assim podemos determinar possíveis causas de deterioração da qualidade da água. 4

6 A composição em g/l (gramas por litro) do agar contendo o meio de bactérias heterotróficas é a seguinte: Digerido pancreático de caseína: 5,00 Extrato de levedura: 2,50 Dextrose: 1,00 Agar: 15,00 As colônias irão desenvolver diversas colorações, como por exemplo, às que estão ilustradas na foto abaixo. O tempo de incubação é de 48 horas a 35 ±1 C. OBS: Em caso de contagem incontáveis de Bactérias heterotróficas a amostra deverá se diluída, 1 ml (amostra) para 99 ml (água destilada e autoclavada) depois realizar a filtração. Neste caso o valor da contagem obtido deve ser expresso em UFC/mL. 5

7 3.2 - Clostridium perfringens A determinação de esporos de Clostridium perfringens em água é uma importante avaliação de contaminação fecal remota, útil em situações onde outros indicadores de menor resistência, tais como E. coli, já não se encontrariam mais presentes. O Clostridium perfringens é uma bactéria anaeróbia em forma de bastonete, sulfito redutora, amplamente distribuída na natureza e considerada como parte da microbiota intestinal do homem e de animais. Os esporos são eliminados nas fezes e dessa forma chegam ao meio aquático onde apresentam excepcional longevidade, em função da grande resistência a condições ambientais desfavoráveis. Após realizar as filtrações, seguir o procedimento: Colocar as placas na jarra de anaerobiose em posição não invertida ; Colocar o Aerokit na jarra; Retirar a tampa; Adicionar vagarosamente 15 ml de água; Deixar sem tampa Feche a jarra de anaerobiose e deixe a 35±1 C por um período de 24 horas. A composição em g/l do agar é a seguinte: Caseína enzimática hidrolizada: 3,70 Digestão peptídica de tecido animal: 3,70 Triptose: 7,50 Extrato de levedura: 1,20 Lactose: 9,40 Fosfato dipotássico: 3,30 Sulfato lauril de sódio: 0,05 Sulfito de sódio: 1,60 Agar: 15,00 6

8 As colônias irão se desenvolver com características típicas (coloração amarelo claro, de 1 a 3 mm de diâmetro, convexas em sua superfície, com bordas lisas e opacas). 7

9 3.3 - E.coli / Coliformes totais As águas de abastecimento e águas minerais apresentam o risco de serem poluídas por águas residuárias e excretas de origem animal ou humano, podendo, desta forma, conter microorganismos patogênicos, tornando-se assim um veículo de transmissão de doenças. O trato gastrointestinal do homem e dos animais, rico em microorganismos, em quantidade e variedade, é uma das principais fontes de agentes patogênicos. Em condições precárias de higiene, esses microorganismos entéricos podem contaminar as mãos dos manipuladores e, consequentemente, os alimentos por eles preparados. A higienização de equipamentos e utensílios constitui outro fator relevante de risco, favorecendo a contaminação cruzada, cuja fonte pode ser a matéria prima, o ar, a poeira e o próprio manipulador. A presença de coliformes é o melhor indicativo de deficiência na higiene nas indústrias de águas minerais. Como o grupo dos coliformes totais inclui gêneros que não são de origem exclusivamente fecal, isto limita sua aplicação como indicador específico de contaminação fecal. O reconhecimento deste fato levou ao desenvolvimento de métodos de enumeração de um sub-grupo de coliformes denominados coliformes fecais (termo tolerantes), os quais são diferenciados dos coliformes totais pela sua capacidade de fermentar a lactose em temperatura elevada. A definição do grupo de coliformes totais inclui as bactérias na forma de bacilos Gram-negativos, não formadores de esporos, aeróbios ou anaeróbios facultativos. O grupo inclui cerca de 20 espécies, dentre as quais se encontram tanto bactérias originárias do trato gastrintestinal de humanos como também diversos gêneros e espécies de bactérias não entéricas. Todos os sistemas analisados deverão apresentar resultados negativos, isto é, ausência em 100 ml. Para facilitar as análises, a KITLABOR disponibiliza a placa E.coli/coliformes totais, onde pode-se obter os 2 grupos na mesma placa e na mesma temperatura. 8

10 A composição em g/l do agar contendo o meio E.coli/coliformes totais é a seguinte: Peptona especial: 5,00 Cloreto de sódio: 5,00 Sorbitol: 1,00 Lauril sulfato de sódio: 0,10 Substrato cromogênico: 0,08 Substrato fluorogênico: 0,05 Agar: 15,00 A placa é incubada a 35±1 C por 24 horas. Após esse período, faz-se então a leitura. Para coliformes totais, as colônias ficarão verdes à azul. Terminada a contagem das mesmas, levar a placa numa lâmpada de luz negra. Se ocorrer brilho em alguma colônia, esta será E. coli (coliforme fecal). Aconselhamos que para facilitar a leitura destas colônias, deve-se fazer em local escuro. Segue abaixo fotos exemplificando-as. Coliformes Totais E. coli 9

11 3.4 - Enterococos O habitat normal destes grupos de bactérias é o trato intestinal humano e de outros animais, estas bactérias normalmente não ocorrem em águas e solos de áreas não poluídas, sendo que as poucas incidências estão relacionadas diretamente a animais de vida selvagem ou à drenagem dos solos por enxurradas. Embora estas bactérias possam persistir por longos períodos em águas de irrigação com alto teor eletrolítico, geralmente não se multiplicam em águas poluídas, sendo, portanto, sua presença indicativa de contaminação fecal recente. Este grupo de bactérias engloba várias espécies que apresentam diferentes graus de resistência às variações ambientais e origens fecais específicas. Assim, as espécies incluídas no gênero Enterococcus apresentam maior resistência e são caracterizadas por sua capacidade de crescer em temperaturas de 10 a 45 C, ph de até 9,6 e em meios com altas concentrações de NaCl. Além disso, conseguem sobreviver a temperaturas de 60 C durante 30 minutos. As placas de Petri contendo o meio de cultura Agar são colocadas em estufa a 35±1 C durante 48 horas. A coloração das colônias varia do rosa ao vermelho escuro. A composição em g/l do agar contendo o meio de Enterococos é a seguinte: Triptose: 20,00 Extrato de levedura: 5,00 Dextrose: 2,00 Fosfato dipotássio: 4,00 Agar: 10,00 A foto abaixo ilustra a presença de Enterococos em uma análise realizada em laboratório. 10

12 3.5 - Pseudomonas aeruginosa A diversidade bioquímica da Pseudomonas aeruginosa e sua resistência a agentes antimicrobianos são fatores que têm determinado um grande interesse em seu estudo, pois contribuem para sua importância como patógeno oportunista, como microrganismo formador de biofilme, interferindo em muitos processos industriais e como microrganismo de importância em processos de deterioração, atacando uma variedade de materiais. Nos últimos anos, seu estudo em águas de piscina tem merecido uma atenção especial e esse interesse deriva do fato de pesquisas recentes terem evidenciado a relação entre a alta incidência de otite em nadadores e a presença de Pseudomonas aeruginosa nessas águas recreacionais. A contaminação dessas águas por Pseudomonas aeruginosa pode ser decorrente de sua introdução através da pele de banhistas, da superfície da pele contaminada por matéria fecal, da urina ou de contaminação da própria fonte de água que abastece as piscinas. A presença desta bactéria em águas minerais envazadas em garrafões plásticos reutilizáveis (normalmente de 20 litros) também tem sido constantemente relatada, especialmente pela grande produção de biofilme no interior destes recipientes e a má higienização destes nas empresas engarrafadoras, determinando a deterioração da água (alteração de sabor, odor e aparência), além de poder contribuir para a disseminação de um patógeno oportunista de extrema importância. As placas de Petri contendo o meio de cultura Agar são incubadas a 35±1 C por aproximadamente 24 horas. A composição em g/l do agar contendo o meio de Pseudomonas aeruginosa é a seguinte: Digestão pancreática de gelatina: 20,00 Cloreto de magnésio: 1,40 Sulfato de potássio: 10,00 Cetrimida: 0,300 Agar: 15,00 11

13 O crescimento das colônias tem de 0,8 a 2,2 mm de diâmetro de aparência achatada com coloração acastanhada à esverdeada. 12

14 3.5.1 Confirmação da Pseudomonas aeruginosa em Agar leite Após a contagem e o registro do número de colônias típicas de Pseudomonas aeruginosa, selecionar um número adequado de colônias (1 a 4) para serem submetidas à confirmação. Procedimento de confirmação. Selecionar colônias típicas bem isoladas, para serem submetidas ao procedimento de confirmação. Flambar e resfriar uma alça de inoculação. Com a alça de inoculação, devidamente flambada e resfriada, colher uma colônia a ser submetida à confirmação. Depositar a colônia colhida nas bordas da placa de ágar leite, e iniciar seu espalhamento na superfície. Fechar e incubar a placa em posição invertida durante 48 ± 3h a 35 ± 0,5 C. Após o período determinado de incubação, efetuar a leitura considerar presença, como típicas de P. aeruginosa as colônias produzirem pigmento amarelado a verde, difusível no meio de cultura como apresenta a imagem abaixo. 13

15 4 - TEMPO DE INCUBAÇÃO DAS PLACAS BACTÉRIAS TEMPO DE INCUBAÇÃO VALOR MÁXIMO PERMITIDO Bactérias heterotróficas 48 horas Sem especificação Clostridium perfringens 24 horas Ausência E.coli / coliformes totais 24 horas Ausência Enterococos 48 horas Ausência Pseudomonas aeruginosas 24 horas Ausência Confirmação Pseudomonas 48 horas - 14

16 5 AMOSTRAGEM COM SWAB Coleta Retire o swab da embalagem protetora estéril; Faça a amostragem em uma área de 10x10 cm área plana ; Coloque o swab plástico no tudo contendo a solução tamponada; Com a ponta do swab no fundo do tubo quebre a haste fazendo uma leve pressão da mesma na borda do tubo; Identifique a amostra. Análises Faça uma diluição, colete 2 ml do SWAB e coloque em 200 ml de água destilada e autoclavada; Filtrar a amostra e encaminhar para a estufa; OBS: Diluição específica para dois parâmetros. Exemplo: Coliformes totais / E. coli e Bactérias Heterotróficas. Resultados Realizar e contagem de colônias; O resultado sairá em UFC/mL; 15

17 6 AMOSTRAGEM DO AR Indicações: Quantificar a presença de microrganismos no ar por sedimentação. Nesta técnica, os microrganismos irão se depositar na superfície do meio de cultura sólido. Movimentos no ambiente que está sendo amostrado modificam o fluxo de ar e consequentemente o resultado da análise. OBS: Utiliza-se placa de 90 mm para contagem de Bactérias mesófilas totais e bolores e leveduras. Procedimento: a) Identificar a placa b) Expor a placa aberta por 15 minutos c) Tampar a placa O transporte até o laboratório deve ser refrigerado e realizado em até 24 horas a partir da coleta A placa deve ser incubada na temperatura e tempo recomendados para o microrganismo pesquisado Calcular o resultado da seguinte forma: Nº de colônias/placa realizar a contagem das colônias Nº de colônias/min realizar a contagem das colônias e dividir a contagem por 15 Nº de colônias/h realizar a contagem das colônias e dividir a contagem por 0,25 Nº de colônias/cm 2 realizar a contagem das colônias e dividir a contagem por 56 Nº de colônias/m 2 realizar a contagem das colônias e dividir a contagem por 0,0056 Referência Bibliográfica: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, section 3.71 and 3.72, American Public Health Association, Washington D.C.,

18 7 DESCARTE DE PLACAS CONTAMINADAS As placas incubadas devem ser descontaminadas antes do descarte ou recolhidas por empresa especializada como sendo resíduo de risco biológico. Os resíduos biológicos são aqueles que apresentam produtos biológicos que podem ou não representar risco potencial à saúde pública e ao meio ambiente, devido à presença de microrganismos que, por suas características de maior virulência ou concentração, podem apresentar risco de infecção. A descontaminação pode ser realizada em autoclave, porém ocasiona odor ruim. Para a descontaminação de materiais contaminados: Coloque 1 ml de álcool 70% sobre a placa com crescimento e deixe de repouso por 5 minutos. Após este período, descarte no lixo orgânico comum. S.A.C - KITLABOR COMÉRCIO DE PRODUTOS PARA LABORATÓRIO LTDA Rua Heitor Blum nº 310 Sala 110 Bairro Estreito Florianópolis / SC CEP: CNPJ: / Fones: (48) / Técnicos: (48) (WhatsApp) contato@kitlabor.com.br 17