Aula 3. Instrumentação e técnicas básicas de assepsia. Profa. Dra. Ilana Camargo

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1 Aula 3 Instrumentação e técnicas básicas de assepsia Profa. Dra. Ilana Camargo

2 Instrumentos Câmara de biossegurança / fluxo laminar Autoclave Esterilização pelo calor úmido (vapor sob pressão) Em geral: 15 a 20 minutos a 121ºC

3 Esterilização Bico de Bunsen Autoclave Filtro esterilizante Câmara de Biossegurança

4 Equipamentos

5 Equipamentos Estufa

6 Materiais Fechar com tampão de algodão e cobrir com papel alumínio e papel pardo

7 Rotina do laboratório Tubos cônico (tipo falcon) Microtubos ( tubo Eppendorf ) Balão volumétrico Proveta Erlenmeyer Frasco com tampa de rosca Béquer

8 Rotina do laboratório Balança de precisão Centrífuga phmetro

9 Rotina do laboratório Agitador magnético com aquecimento Banho-maria Barras magnéticas ( pulgas ou peixinhos ) Agitador de tubos (vórtex)

10 NUNCA PIPETE COM A BOCA!!!

11 Instrumentos Pipetas e pipetadores

12 Instrumentos Pipetas automáticas Pipeta Pastuer Ponteiras

13 Instrumentos

14 Como cultivar os microrganismos??

15 Onde isolar? Meios de cultura: Material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de microrganismos. Fazer a partir de pós desidratados; Comprar meios preparados (prontos para o uso) Onde colocar? Placas de Petri; Tubos de ensaio. Como escolher o meio para o isolamento? A) origem do material a ser analisado; B) A espécie que se imagina estar presente; C) Necessidades nutricionais dos organismos.

16 Meios Líquidos, semi-sólidos e sólidos Agar foi descoberto no Japão (Kanten) a partir de algas marinhas e é utilizado em comidas. Holandeses passaram a usar agar em alimentos; Fannie Hess, esposa do pesquisador Walter Hess utilizava agar em geléias. Walter testou em meios de cultura e escreveu para Robert Koch Até cerca de 1880, as culturas eram todas líquidas. Koch havia tentado usar gelatina, mas esta derretia a 37 C. Ao ver a utilidade do agar, Robert Koch passou a utilizá-lo em meios de cultura para o cultivo de bacilos da tuberculose. AGAR Sem cor Sem gosto Sem odor Gelatinoso Bactérias não o degradam!

17 Diferentes concentrações de ágar diferentes estados físicos Sólidos contém agentes solidificantes, principalmente ágar (cerca de 1 a 2,0 %); Semi-sólidos a quantidade de ágar é de 0,075 a 0,5 %, dando uma consistência intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas; Líquidos sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros.

18 H 2 O H 2 O H 2O H 2 O Autoclavar 121 C por 20 minutos Distribuir em placas estéreis

19 Meio autoclavado = Calor!!

20 Materiais Tubos de ensaio Placas de Petri

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23 Placas de Petri Placas de Richard Petri

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25 Meios de cultura Profa. Dra. Ilana Camargo

26 Microrganismos em meio de cultura 26

27 Meios de Cultura Soluções nutrientes utilizadas para promover o crescimento de microrganismos em laboratório. Inóculo: microrganismos que são colocados em um meio de cultura para iniciar o crescimento. Cultura: microrganismos que crescem e se multiplicam nos meios de cultura. Meios Quimicamente definidos: Quantidades precisas de compostos químicos inorgânicos ou orgânicos altamente purificados, adicionados a água destilada. Complexos (ou indefinidos): Não se conhece a composição precisa de alguns componentes. Empregam produtos de digestão da caseína (proteína do leite), de carne, de soja, de leveduras, extratos de plantas, entre outros. 27

28 Microrganismos em meio de cultura complexo Composição: Peptona (Fonte de nitrogênio) Triptose (reações de fermentações) Extrato de carne (carboidratos, constituintes minerais, vitaminas) Extrato de leveduras (Fonte de vitaminas) Água (destilada / deionizada) Sangue (Fator de crescimento, rico em nitrogênio, carboidratos e vitaminas) 28

29 Ágar: polissacarídeo complexo solidificante obtido de algas marinhas. Poucos microrganismos degradam o ágar. Temperatura de fusão inferior à temperatura da água. Permanece líquido até 40ºC. Na técnica de Pour plate o ágar é mantido a 50ºC e é adicionado sobre o inóculo sem afetar, ou causar danos a bactéria. Dependendo de sua concentração os meios podem ser classificados quanto a consistência: - Líquido menos de 1g de ágar por litro de água - Semi-sólido 4 g/l - Sólido 15 a 18 g/l 29

30 Classificação quanto à função dos meios: -Seletivo -Diferencial -Enriquecedor -Rico -Transporte 30

31 Meios Seletivos Favorece o crescimento da bactéria de interesse impedindo o crescimento de outras bactérias. Inibidores: substâncias capazes de inibir algumas bactérias que não são de interesse. 1) Corantes: verde brilhante, eosina, cristal violeta... 2) Metais pesados: Bismuto; 3) Substâncias químicas: azida, citrato, desoxicolato, selenito e álcool feniletílico... 4) Agentes antimicrobianos: vancomicina, cloranfenicol 5) Meio hipertônico: alta concentração de sal (7,5%) 31

32 Meio Diferencial Utilizado para fácil detecção da colônia da bactéria de interesse quando existem outras bactérias crescendo na mesma placa do meio Substâncias utilizadas como indicadores de atividade enzimáticas que auxiliam na identificação -Indicadores de ph: fucsina, azul de metileno, vermelho neutro, vermelho de fenol e púrpura de bromocresol. Medem as variações de ph que resultam do metabolismo bacteriano de certos substratos. - Indicadores diversos: detectam produtos bacterianos específicos. Ex.: íons ferro e ferroso para a detecção de sulfato de hidrogênio 32

33 Indicadores de ph comumente usados em microbiologia Indicador ph ácido ph básico Andrade róseo amarelo Púrpura de bromocresol amarelo púrpura Azul de bromotimol amarelo azul Vermelho de ortocresol amarelo vermelho Vermelho de metila vermelho amarelo Vermelho neutro vermelho amarelo Vermelho de fenol amarelo vermelho 33

34 C.L.E.D. Cistina Lactose Eletrólitos - Deficiente Peptona...7 Extrato de levedura...2 Extrato de carne...2 Cistina...0,128 Lactose...10 Azul de Bromotimol...0,03 Ágar...12 Nitrogênio e carbono Açúcar Indicador de ph 34

35 CLED (Cistina Lactose- Eletrólitos-Deficientes) Com indicador azul de bromotimol Lactose + (Amarelo) Meio diferencial 35

36 CLED (Cistina Lactose- Eletrólitos-Deficientes) Com indicador de Andrade!! Lactose + (Rosa) Meio diferencial 36

37 Ágar MacConkey Peptona de carne...3 Peptona de caseína...17 NaCl...5 Lactose...10 Sais biliares...1,5 Vermelho neutro...0,03 Cristal violeta...0,001 Ágar...13,5 Nitrogênio e carbono Açúcar Inibidor de Gram+ Indicador de ph Inibidor de Gram+ 37

38 Meio Seletivo e Diferencial Muito utilizado na rotina laboratorial Ágar MacConkey Seletivo e Diferencial Seletivo: Cristal violeta e sais biliares inibem bactérias Gram-positivo; Diferencial: Este meio possui indicador de ph, por exemplo vermelho neutro: quando o meio fica ácido a cor fica rosa. Possui lactose que a bactéria pode degradar (fermentar) produzindo ácido que diminui o ph do meio. 38

39 Lactose + Lactose - MacConkey Cultura mista!!!!!! Seletivo para enterobactérias (Gram-negativo) a partir de fezes, urina, alimentos, água... 39

40 MacConkey Cultura mista!!!!!! 1. Lactose 2. Lactose + Sais biliares e cristal violeta inibem Gram-positivas Meio seletivo e diferencial 40

41 Ágar Manitol Hipertônico Peptona...10 Extrato de carne...1 NaCl...75 Manitol...10 Vermelho de fenol...0,025 Ágar...12 Nitrogênio e carbono Inibidor de algumas Gram+ e das Gram - carboidrato Indicador de ph Meio Seletivo e Diferencial 41

42 Ágar Manitol Hipertônico Manitol - Indicador Vermelho de fenol!!! Manitol + A degradação do manitol está relacionada com a patogenicidade, indicativo da presença de Staphylococcus aureus. Crescem apenas bactérias que suportam grande concentração de sal! 42

43 E.M.B. (Eosina Azul de metileno) Para isolamento de Enterobactérias (Gram negativo) Corantes inibem Gram-positivo Brilho verde metálico Escherichia coli??? Bactérias produtoras de ácidos fortes formam brilho verde metálico causado pela precipitação do corante nas colônias: SUGESTIVO de E. coli!!! Meio seletivo e diferencial 43

44 E.M.B. (Eosina Azul de metileno) Para isolamento de Enterobactérias (Gram negativo) Corantes inibem Gram-positivo Colônias pardo rósea Produtora de ácido fraco Ex: Enterobacter sp Meio seletivo e diferencial 44

45 Meios de Cultura Seletivo: Favorece o crescimento do microrganismo de interesse e impede o crescimento de outros. Ex.: Ágar sulfeto de bismuto para isolamento de Salmonella typhi a partir das fezes. Meios Diferencial: Permite a fácil identificação da colônia da bactéria de interesse, dentre as colônias de outras bactérias crescidas no meio. Ex.: Meio ágar sangue para detectar a presença de Streptococcus pyogenes (forma-se um halo claro em torno da colônia pela lise das hemáceas) 45

46 Meio de enriquecimento Incrementa o crescimento de certas espécies bacterianas ao mesmo tempo que inibe o desenvolvimento de microrganismos que não sejam de interesse. 46

47 Caldo selenito e Caldo GN Partem do princípio de que a E. coli e outros Gram-negativos da microbiota normal são mantidos em fase de latência (Lag) prolongada pelas substâncias químicas inibidoras. As espécies de Salmonella e Shigella são menos inibidas, entram em uma fase de crescimento exponencial (Log) e são isoladas com mais facilidade de amostras fecais. 47

48 Caldo GN Triptose...20 Glicose...1 Manitol...2 Hidrogenofosfato potássico...4 NaCl...5 Citrato de sódio...5 Desoxicolato de sódio...0,5 Base nutritiva!! carboidrato carboidrato Tampão Inibidores de Gram+ 48

49 Caldo selenito e Caldo GN Incubação de no máximo 8 horas Meio seletivo X.L.D. ou Hektoen ou SS 49

50 Ágar SS (Salmonella/Shigella) Peptonas...10 Lactose...10 Bile de boi dessecada... 8,5 Citrato de sódio...10 Tiossulfato de sódio...8,5 Citrato de amônio e ferro III...1 Verde brilhante...0,0003 Vermelho neutro...0,025 Ágar...12 Nitrogênio e carbono carboidrato Inibidores de Gram+ e algumas Gram - Indicador de H 2 S Indicador de ph 50

51 Ágar SS (Salmonella/Shigella) Salmonella sp Lactose - (Transparente) Produção de H 2 S (Com centro negro) Meio Seletivo e diferencial: verde brilhante, bile e alta concentração de tiossulfato e citrato inibem a microbiota acompanhante de fezes, alimentos e outros materiais. Lactose + E. coli - cor rosa 51

52 Rico X Enriquecimento Rico: é o meio que é suplementado com sangue, soro, suplementos vitamínicos e extrato de levedura para isolar microrganismos exigentes. Ex: ágar Mueller Hinton suplementado com 5% de sangue de carneiro e ágar chocolate Meio de enriquecimento: Incrementa o crescimento de certas espécies bacterianas ao mesmo tempo que inibe o desenvolvimento de microrganismos que não sejam de interesse. Ex.: Caldo GN e Caldo selenito. 52

53 Ágar Mueller Hinton suplementado com sangue de carneiro a 5%. Meio rico Permite o crescimento da maioria das bactérias Colônia Hemólise 53

54 Meios de Cultura Seletivo: Favorece o crescimento do microrganismo de interesse e impede o crescimento de outros. Ex.: Ágar sulfeto de bismuto para isolamento de Salmonella typhi a partir das fezes. Meios Diferencial: Permite a fácil identificação da colônia da bactéria de interesse, dentre as colônias de outras bactérias crescidas no meio. Ex.: Meio ágar sangue para detectar a presença de Streptococcus pyogenes (forma-se um halo claro em torno da colônia pela lise das hemáceas) de Enriquecimento: Semelhante ao seletivo, mas suplementado por nutrientes especiais, com a característica de aumentar o número da bactéria de interesse tornando-a detectável. 54

55 Meio de transporte Stuart Mantem o microrganismo viável, mas impede o crescimento e multiplicação até o subcultivo em meio adequado. Glicerol fosfato de sódio...10 Tioglicolato de sódio...1 Cloreto de cálcio...0,1 Azul de metileno...0,002 Ágar

56 Microrganismos em meio de cultura 56

57 Meio Mueller Hinton Pseudomonas aeruginosa Pigmento verde natural Escherichia coli Brilho verde metálico somente no meio EMB! Meio EMB Serratia marcescens Pigmento vermelho natural!! 57

58 Método de esgotamento em placa Por estriamento 58