Prof. Paulo Hercílio Viegas Rodrigues LPV-ESALQ-USP

Transcrição

1 Meios de Cultura: Componentes e Tipos de Meios Prof. Paulo Hercílio Viegas Rodrigues LPV-ESALQ-USP

2 Meios de Cultivo Meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de organismos fora do seu meio natural.

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5 Meios de Cultivo - Soluções inorgânicas simples: Solução de Knop (1865) Solução de Knudson (1925) Solução de Hoagland & Arnon (1938) - Soluções mais completas: White (White, 1943) MS (Murashige & Skoog, 1962) B5 (Gamborg et al, 1968) KM (Kao & Michayluk, 1975)

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8 Componentes Meio Nutritivo Reguladores de Crescimento Fontes de Carbono Mio-inositol Vitaminas Sais Minerais água

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10 Critérios de Essencialidade

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13 Casos Aula em Cuiabá! 2- Guia com seqüência dos sais e orgânicos na preparação do meio de cultivo (evita colocar 2 x a mesma solução!!)

14 Fácil e $$$$...

15 Componentes Orgânicos Vitaminas -São fatores catalíticos de rotas metabólicas nas células; -São utilizadas fração de 1 mg/l a 10 mg/l * Primeiros trabalhos em cultura de tecidos -Definida a mistura básica de vitaminas: B1 (tiamina), B6 (piridoxina), ácido nicotínico (niacina), ácido pantotênico e ácido ascórbico. Tiamina: exerce maior estímulo para o crescimento.

16 Componentes Orgânicos Mio-inositol: É um hexitol ou composto cíclico com grupos -OH em todos os seus carbonos. a concentração mais usada é 100 mg/l é incorporado a moléculas de fosfolipídeos da membrana plasmática.

17 Componentes Orgânicos Fonte de Carbono: Células, tecidos e órgãos cultivados in vitro: # são heterotróficos; # dependem de fonte externa de energia; # necessário incorporar fonte de carbono. - Fornecem energia e esqueletos de carbono para: * biossintese de polissacarídeos, aminoácidos e proteínas, enfim para o crescimento da célula.

18 Componentes Orgânicos Fonte de carbono: Sacarose 2-3%: - é a mais utilizada nos meios (açúcar cristal); - em presença de auxina contribui para a diferenciação celular. Outros açúcares (frutose, glicose, maltose, galactose, celobiose). Ácidos orgânicos e alcoóis (sorbitol) Em excesso conservam material vegetal (agente osmótico) crescimento mais lento da cultura.

19 Componentes Orgânicos Misturas complexas: água de coco extrato de levedura extrato de malte água de coco é a mais utilizada: - estimula o crescimento de calo, - aumenta a formação de embriões somáticos, - induz o desenvolvimento de embriões imaturos. * Endosperma líquido!

20 Reguladores de crescimento Substâncias orgânicas que regulam o crescimento, diferenciação e desenvolvimento das plantas em baixas concentrações (0,1 100 µm). Auxinas Citocininas Giberilinas Ac. Abscísico Etileno

21 Reguladores de crescimento AUXINAS: crescimento e alongamento celular divisão celular indução e crescimento de raízes dominância apical produção de etileno In vitro: divisão celular enraizamento indução de calo embriogênese somática

22 Reguladores Abreviatura P.M Auxinas Ácido 3-indolacético AIA 175,20 Ácido naftalenoacético ANA 186,20 Ácido indolbutírico AIB 203,23 Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 2,4-D 221,04 Ácido 4-clorofenoxiacético 4-CPA 184,50 Ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico Picloran 241,46 Ácido naftóxiacético NOA 202,21

23 Reguladores de crescimento Auxinas AIA AIB ANA 2,4-D 2,4,5-T Picloran Dicamba Naturais Sintéticas Substitutos de auxinas

24 Reguladores de crescimento Auxinas no meio de cultura: - ANA bastante utilizado em protocolos de estabelecimento (cerca de 51%); - 2,4-D indução de calo mesmo em baixa concentração; - AIB muito utilizado para enraizamento; - AIA menos estável em meio de cultura (fotoxidação e ação da AIA-oxidase).

25 Reguladores de crescimento CITOCININAS: derivadas da adenina (base púrica). In vitro: divisão celular quebra da dormência apical morfogênese (gemas adventícias) desenvolvimento de brotos laterais

26 Reguladores de crescimento Reguladores Abreviatura P.M Citocininas 6-Benzilaminopurina ou 6- Benziladenina 6-Furfurilaminopurina ou Cinetina BAP ou BA 225,20 CIN 215,20 Isopenteniladenina 2iP 203,30 Zeatina ZEA 219,20 Tidiazuron TDZ 220,20

27 Reguladores de crescimento Citocininas Zeatina 2iP Naturais BAP ou BA Cinetina Sintéticas TDZ Substituto de citocinina

28 Reguladores de crescimento Citocininas no meio de cultura - em excesso é tóxica, produzindo: *Demasiado entufamento; *Falta de alongamento das culturas; *Redução do tamanho das folhas; *Encurtamento dos entre-nós; *Hiperidricidade (vitrificação); *Dificuldade de enraizamento; *Variação somaclonal.

29 Dissolver os Reguladores de Crescimento? Auxinas (Ac. Orgânicos): dissolver em base (KOH) 3 gotas para cada 10 mg. Citocininas (Base Orgânica): dissolver em ácido (HCl) 3 gotas para cada 10 mg. * Preparar solução concentrada e armazenar em Freezer.

30 Estágios da propagação in vitro Chapter 4 Chapter 2 Chapter 3 Chapter 4 0 I II Selection of a superior Stage I: Introduction of germplasm aseptic cultures Stage II: Multiplication III Stage III: Rooting and preparation IV Stage IV: Acclimatization Growth In vitro under photomixotrophic conditions In vitro under photoautotrophic conditions Ex vitro under controlled environment conditions with artificial light Adaptado de Couceiro (2006)

31 Balanço citocinina/auxina (c/a) Alta relação c/a: promove a proliferação de brotos; suprime a formação de raízes (estádio II). Baixa relação c/a: favorece a formação de raízes (estádio III). Concentrações iguais Concentrações iguais: propiciam a produção de calo.

32 Foto c/a

33 Foto c/a

34 Importante saber!!! 1M = peso molecular em g/l 1mM = 1M/1000 1µM = 1mM/1000 ppm = mg/l % = g/100 ml 1 g = 1000 mg 1mg = 1000 µg

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36 Outros Aditivos Antibiótico e fungicidas: - Controle de contaminação microbiana; - Não apresenta ação fitotóxica. - Benomil (Benlate) - Cefotaxima sódica

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39 Outros Aditivos Polifenóis Antioxidantes Oxidação Escurecimento Morte da planta Carvão ativado Ácido ascórbico Ácido cítrico L-cisteína Polivinilpirrolidona (PVP)

40 Carvão ativado: 1 a 3 % - adsorção de fenóis; - adsorção de componentes orgânicos (auxinas e citocininas); - contribui para a morfogênese e embriogênese; - desenvolvimento de raízes; - estabiliza ph.

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43 Meios de cultura forma física Líquido Semi sólido: Agar Goma (Gelrite, Phytagel) Agarose Bifásico: meio semi-sólido coberto com meio líquido.

44 Meio de cultura líquido Condições de cultivo + uniformes; Renovação do meio sem mudança de recipiente; Esterilização pode ser por microfiltração; Lavagem dos recipientes + fácil; Asfixia e hiperidratação dos explantes distúrbios fisiológicos.

45 Sistemas de suporte Agar: mistura de polissacarídeos derivados de algas marinhas. - fusão: 100C - solidificação: 45C - concentração: 0,6 1,0% Não reage com componentes do meio de cultivo; Não é digerido pelas enzimas das plantas; Não solidifica em ph ácido; Impurezas (sais inorgânicos, compostos orgânicos, fenóis, etc)

46 Sistemas de suporte Goma: polissacarídeo produzido pela bactéria P.elodea; Phytagel (Sigma), Gelrite (Merck) 0,2% Mais translúcido que o ágar (contaminação) Impurezas (sais inorgânicos) Não contém componentes orgânicos Solidifica na presença de ions de Ca e Mg Agarose: extraído do ágar, alto grau de pureza Mecânico: pontes de papel de filtro (meio líquido).

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51 Variantes Somaclonais de H.bihai, obtidas in vitro.

52 Variantes Somaclonais de H.bihai, obtidas in vitro. Variabilidade genética que ocorre em decorrência do processo in vitro! repicagens, reguladores de crescimento e tempo de cultivo.