ESTABELECIMENTO DE PROTOCOLO DE DESINFESTAÇÃO DE EXPLANTES FOLIARES DE BRAÚNA (Melanoxylon brauna SCHOTT)

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1 ESTABELECIMENTO DE PROTOCOLO DE DESINFESTAÇÃO DE EXPLANTES FOLIARES DE BRAÚNA (Melanoxylon brauna SCHOTT) Elisa Regina da Silva 1, Kelly Nery Bighi 1, Ingridh Medeiros Simões 1, Rodrigo Sobreira Alexandre 1, Marcus Vinícius Winckler Caldeira 1, Edilson Romais Schmildt 2, José Carlos Lopes 3. 1 Universidade Federal do Espírito Santo/Departamento de Ciências Florestais e da Madeira, Avenida Governador Lindemberg, 316, Jerônimo Monteiro-ES, Brasil, elisa_agronomia@hotmail.com, kellyneryb@yahoo.com.br, simoes.ingridh@gmail.com, rodrigosoreiraalexandre@gmail.com 2 Universidade Federal do Espírito Santo, Departamento de Ciências Agrárias e Biológicas, Centro Universitário Norte do Espírito Santo, Rodovia Governador Mário Covas, Km 60, , Bairro Litorâneo, São Mateus-ES, Brasil, e.romais.s@gmail.com 3 Universidade Federal do Espírito Santo/Departamento de Agronomia, Alto Universitário s/n, , Alegre-ES, Brasil, jcufes@bol.com.br. Resumo A cultura de tecidos vegetais tem sido utilizada com sucesso na propagação de espécies lenhosas, e pode ser uma alternativa para produção de mudas de braúna, visto que esta possui baixa produção de sementes viáveis. Objetivou-se com o estudo, estabelecer um protocolo de desinfestação de explantes foliares de bráuna. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com cinco tratamentos, quatro repetições de seis explantes foliares cada. Os explantes foram previamente tratados com álcool 70% (30 seg.) e hipoclorito de sódio 1% (5 min.). Os tratamentos para desinfestação foram: sem captan e sem amoxicilina ; Captan com resíduo; Captan sem resíduo; Captan com resíduo + amoxicilina e Captan sem resíduo + amoxicilina. Foram analisadas a contaminação e a oxidação dos explantes aos 20 dias da instalação do experimento. Os resultados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey a 5% de probabilidade. Conclui-se que o melhor tratamento de desinfestação de explantes foliares de Melanoxylon brauna foi o uso do de Captan 2% por 10 minutos sem resíduo. Palavras-chave: cultura de tecidos vegetais, contaminação, Fabaceae, espécies florestais. Área do Conhecimento: Engenharia agronômica- engenharia florestal Introdução Melanoxylon brauna Schott, é uma espécie nativa da Floresta Atlântica, pertencente à família Fabaceae, possui madeira dura e densa, por isso é muito utilizada na indústria de navegação, na fabricação de mobílias, postes de iluminação e mourões de cerca (CARVALHO, 2007). Devido a sua intensa exploração e à falta de replantios, a braúna tem sido raramente registrada nos levantamentos florísticos realizados na Floresta Atlântica e está classificada como vulnerável na Lista Oficial de Flora Ameaçada em Extinção (IBAMA, 2018). As sementes de braúna são muito atrativas à insetos, e atualmente, a baixa produção de sementes viáveis, tem se tornado um entrave para a produção de mudas da espécie (CORTE et al., 2010). No entanto, a propagação de espécies por meio da cultura de tecidos vegetais, técnica em que se utiliza órgãos, tecidos ou parte de plantas, denominados explantes, vem sendo utilizada com sucesso e se mostra viável na propagação de espécies lenhosas (SANTOS; CHAGAS; GUIMARÃES, 2015). Porém, os principais entraves para o estabelecimento in vitro dessas espécies são o elevado nível de contaminação exógena dos explantes causada por fungos e bactérias, e a oxidação fenólica dos tecidos (LANDA et al., 2000). Neste sentido, a desinfestação dos explantes é determinante para o sucesso da propagação in vitro, pois além de ser eficiente na eliminação dos microrganismos, precisa permitir uma a atividade morfogenética dos tecidos (RODRIGUES, 2003). A fim de contribuir com os estudos em braúna, 1

2 objetivou-se com o presente trabalho, estabelecer um protocolo eficiente de desinfestação de explantes adultos de Melanoxylon brauna. Metodologia O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Departamento de Ciências Florestais e da Madeira, da Universidade Federal do Espírito Santo em Jerônimo Monteiro- ES. Os explantes foram retirados de uma árvore matriz localizada na comunidade Oriente em Alegre- ES, nas coordenadas S e W. Foram coletadas aproximadamente 20 folhas de ramos novos que foram transportadas até o laboratório em recipiente com água para evitar a desidratação dos tecidos. Os folíolos foram retirados e lavados previamente em água corrente e detergente neutro. Em câmara de fluxo laminar, os folíolos foram imersos em álcool 70% por 30 segundos, em seguida, em hipoclorito de sódio (NaClO) a 1% durante 5 minutos, e após a imersão em cada um dos agentes desinfestantes, procedeu-se com a tríplice lavagem em água destilada e autoclavada por 30 minutos à temperatura de 121 ºC e a pressão de 1 atm. Na sequência, os folíolos foram tratados com captan a 2% durante dez minutos e, após em uma solução de amoxicilina (3 g L -1 ) por dez minutos e o seu resíduo foi retirado com a tríplice lavagem em água destilada e autoclavada. Após a desinfestação, os explantes foram seccionados com lâmina de corte e reduzidos para aproximadamente 1 cm 2 e individualizados em tubos de ensaio contendo 10 ml de meio de cultura autoclavado por 20 minutos composto por 2,41 g L -1 de WPM (Woody Plant Medium) (Sigma ), 0,1 g L -1 de mio-inositol (Sigma ), 30 g L -1 de sacarose (Dinâmica ), 7 g L -1 ágar (Kasvi ), 1 g L -1 de PVP (Polivinilpirrolidona) e o ph foi ajustado para 5,7 ± 0,1. Os tubos com os explantes foram lacrados com filme de PVC e transferidos para sala de crescimento sob temperatura de 27 ± 2 C, com o fotoperíodo de 12 horas. As avaliações de contaminação e oxidação foram realizadas 20 dias após a instalação do experimento. O experimento foi conduzido em DIC (Delineamento Inteiramente Casualizado) com cinco tratamentos e, quatro repetições com seis explantes cada. Os tratamentos consistiram em: Sem captan e amoxicilina ; Captan com resíduo; Captan sem resíduo; Captan com resíduo + amoxicilina ; Captan sem resíduo + amoxicilina. Os resultados foram submetidos à análise de variância e, quando necessário, aplicou-se o teste de Tukey a 5% de probabilidade. Resultados Os explantes tratados somente com álcool 70% e hipoclorito de sódio, apresentaram 100% de contaminação. O uso do Captan com e sem resíduo nos explantes, promoveu redução da contaminação, de aproximadamente 50%. Ao adicionar a amoxicilina, a contaminação reduziu ainda mais (12,5%) (Tabela 1). A oxidação apresentou comportamento inverso ao da contaminação, ou seja, a ausência de captan e amoxilina que ocasionou a maior contaminação, não apresentou oxidação dos explantes. Já o uso do captan e amoxilina, proporcionou a maior taxa de explantes oxidados, (62,5 %). E o uso do captan com e sem resíduo, apresentaram respectivamente, 29,17 e 16,67% de oxidação (Tabela 1). Os explantes que obtiveram as menores porcentagens de contaminação e oxidação, foram com o uso do captan com resíduo, apresentando 41,67% de explantes viáveis (Tabela 1). Tabela 1- Porcentagem de explantes foliares de braúna contaminados (C), oxidados (O) e viáveis, submetidos a diferentes tratamentos de desinfestação. Tratamentos C % O % VIÁVEIS % Sem captan e amoxicilina 100,0 A 0,0 B 0,0 B Captan com resíduo 58,3 B 29,1 B 12,5 AB Captan sem resíduo 41,6 B 16,6 B 41,6 A 2

3 Captan com resíduo + amoxicilina 12,5 C 62,5 A 25,0 AB Captan sem resíduo + amoxicilina 12,5 C 62,5 A 25,0 AB Fonte: Os autores (2018). (1) Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, em nível de 5%, pelo teste de Tukey. Discussão A contaminação total dos explantes ocorreu naqueles não tratados com Captan, indicando que somente o hipoclorito de sódio não é suficiente para desinfestação desse tipo de explante, pois, os folíolos de braúna apresentam muitos pelos na face adaxial, dificultando o contato do agente desinfestante com toda área foliar. O cloro ativo é a substância presente no hipoclorito de sódio responsável pela desinfestação, mas segundo Domini et al. (2005), não se conhece muito bem o mecanismo de ação dessa substância, e a hipótese é de que há uma combinação com proteínas da membrana celular dos microrganismos, que produzem compostos tóxicos e inibem a ação de enzimas essenciais, promovendo a morte dos agentes infestantes e também podem levar à necrose do material biológico. Os explantes não tratados com captan apresentaram tanto contaminação fúngica quanto bacteriana, e devido a esses microrganismos invadirem toda a área do explante, não foi possível identificar a presença de oxidação dos mesmos, por isso, este tratamento apresentou a menor porcentagem de explantes oxidados. A oxidação dos explantes tratados somente com captan foi menor que as dos outros tratamentos devido à ausência da amoxicilina. Porém, nos tratamentos em que usou-se a amoxicilina, a oxidação foi elevada, e a presença ou ausência do resíduo do captan não promoveu diferenças estatísticas entre esses tratamentos. Vários autores como Lima e Moraes (2006), Carneiro et al. (2007), Pereira et al. (2009), Pereira et al. (2011), Brondani et al. (2013) entre outros, estudaram os efeitos do hipoclorito de sódio na desinfestação de explantes na cultura de tecidos, porém, em casos onde a contaminação persiste após o tratamento com esse agente, é necessário procedimento adicionais para obtenção de cultivos livres de contaminantes. Neste sentido o fungicida Captan e o antibiótico amoxicilina foram acrescentados aos tratamento a fim de obter maior porcentagem de explantes viáveis. O captan é um fungicida organoclorado recomendado no controle de diversas doenças fúngicas e para o tratamento de sementes (FISHER et al., 1992). Já a amoxicilina é uma penicilina de amplo espectro bactericida, pois inibe a biossíntese do mucopeptídeo da parede celular das bactérias (ANVISA, 2018). O uso captan resultou em explantes com menor contaminação em relação ao tratamento sem o uso do captan e amoxilina, sugerindo que o captan conseguiu reduzir a presença de microrganismo, especialmente os fungos, dos explantes inoculados. Apesar disso, a contaminação por bactérias nos tratamentos com captan foi elevada, uma vez que a ação do captan é diretamente sobre os fungos e não em bactérias. Os explantes tratados com captan e amoxilina, obtiveram a menor porcentagem de contaminação, 12,5%, indicando que os folíolos de Melanoxylon brauna, possuíam contaminação fúngica e bacteriana. Apesar do efeito positivo no controle da contaminação dos explantes com o uso do captan e amoxilina, estes ocasionaram alta porcentagem de oxidação (62,5%) em ambos tratamentos. Ao comparar as taxas de oxidação dos tratamentos, pode-se observar que o uso da amoxicilina promoveu oxidação dos explantes. A viabilidade do explante foliar é indicada inicialmente pela coloração esverdeada do tecido após a inoculação no meio de cultura, no entanto, os compostos fenólicos comumente presentes no cultivo in vitro de espécies lenhosas, produzem e liberam metabólitos secundários, que ao entrarem em contato com o oxigênio, sofrem oxidação produzindo compostos tóxicos que escurecem e necrosam o tecido vegetal (RODRIGUES et al., 2003). Portanto, para evitar o comprometimento do cultivo por estes compostos, é recomendada a utilização de antioxidantes, neste estudo, foi adicionado o PVP (polivinilpirrolidona) para evitar a oxidação, mas este não foi capaz de evitar ou diminuir a oxidação dos explantes, sendo recomendada a utilização de outros agentes antioxidantes. 3

4 Ao avaliar qual o melhor método de desinfestação, deve-se levar em consideração o tipo de explante, espécie, agentes contaminantes, custo (NIEDZ; BAUSHER, 2002) e mecanismo de ação do agente desinfestante. Porém, Cid (2014) enfatiza que mesmo tomando todos os cuidados de assepsia e utilizando o melhor agente desinfestante, a desinfestação pode não ser totalmente contralada, pois a mesma pode ser endógena. Conclusão A partir dos resultados obtidos, conclui-se que o melhor tratamento, dentre os testados neste estudo, para desinfestação de explantes foliares de Melanoxylon brauna foi o uso do Captan 2% por 10 minutos sem resíduo. Sugere-se que outros agentes desinfestantes sejam testados, pois mesmo o melhor tratamento obtido neste estudo, não foi suficiente para obter uma boa porcentagem de explantes viáveis. Agradecimentos À Fapes e SEAG pelo financiamento da pesquisa do edital Nº 06/ PPE AGROPECUÁRIA. Referências ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Disponível em: < Anexo= >. Acesso em: 25 ago BRONDANI, G. E. et al. Chemical sterilization of culture medium: a low cost alternative to in vitro establishment of plants. Scientia Forestalis, v. 41, n. 98, p , CARNEIRO, M. F. et al. Avaliação de produtos na descontaminação de explantes de banana (Musa AAB cv. Maçã). Pesquisa Agropecuária Tropical, v. 30, n. 1, p , CARVALHO, F. A.; NASCIMENTO, M. T.; BRAGA, J. M. A. Estrutura e composição florística do estrato arbóreo de um remanescente de Mata Atlântica submontana no município de Rio Bonito, RJ, Brasil (Mata Rio Vermelho). Revista Árvore, v. 31, n. 4, p , CID, L. P. B. Cultivo in vitro de plantas. 3. ed. Brasília, DF: Embrapa, 2014, 325 p. CORTE, V. B.; BORGES, E. E. L.; PEREIRA, B. L. C. Adequação da metodologia do teste de tetrazólio para avaliação da viabilidade de sementes de Melanoxylon brauna Schot. Cerne, v. 16, n. 3, p , DOMINI, L. P.; FERREIRA-MOURA, I.; GUISSO, A.P.; SOUZA, J.A.; VIÉGAS, J. Preparo de lâminas foliares de aráceas ornamentais: desinfestação com diferentes concentrações de hipoclorito de sódio. Arquivos do Instituto Biológico, v. 72, n. 4, p , FISHER, H. L.; HALL, L. L.; SUMLER, M. R.; SHAH, P. V. Dermal penetration of captan in young and adult rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, v. 36, n. 1, p , INSTITUTO BRASILEIRO DO MEIO AMBIENTE (IBAMA). Lista oficial de flora ameaçada de extinção. Disponível em: < Acesso em: 04 mai LANDA, F. S. L.; PAIVA, R.; PAIVA, P. D. O.; BUENO, J. S. S. Indução in vitro de calos em explantes foliares de pequizeiros (Caryocar brasiliense Camb.). Ciência e Agrotecnologia, v. 24, p ,

5 LIMA, J. D.; MORAES, W. S. Controle de bactérias contaminantes em explantes de bananeira (Musa cv. Caipira). Pesquisa Agropecuária Tropical, v. 36, n. 3, p , NIEDZ, R. P.; BAUSHER, M. G. Control of in vitro contamination of explants from greenhouse- and field- grown trees. In Vitro Cellular & Developmental Biology- Plant, v. 38, n. 5, p , PEREIRA, G. A. et al. Desinfestação e estabelecimento in vitro de explantes de bananeira IAC 2001 em diferentes concentrações de hipoclorito de sódio. Tecnologia & Ciência Agropecuária, v. 3, n. 2, p , PEREIRA, G. A.; CORREA, L. S.; BOLIANI, A. C. Desinfestação e estabelecimento in vitro de explantes de bananeira 'Grande Naine' em diferentes concentrações de hipoclorito de sódio. Revista Brasileira de Fruticultura, Edição Especial, p , RODRIGUES, A. C., SILVEIRA, C. A. P., FORTES, G. R. L., FACHINELLO, J. C., SILVA, J. B. Estabelecimento e multiplicação in vitro de Prunus sp. em diferentes meios de cultivo. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 25, n. 1, p , SANTOS, M. R. A.; CHAGAS, S. E. S.; GUIMARÃES, M. C. M. Estabelecimento de protocolo para descontaminação de explantes foliares de bacurizeiro (Platonia insignis Mart.). Saber Científico, v. 4, n. 2, p.10-16,