OXIDAÇÃO IN VITRO DE Olea europaea L. RESUMO

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1 5ª Jornada Científica e Tecnológica e 2º Simpósio de Pós-Graduação do IFSULDEMINAS 06 a 09 de novembro de 2013, Inconfidentes/MG OXIDAÇÃO IN VITRO DE Olea europaea L. Thalyta S. Gonçalves 1 ; Wellington M. Barbosa 2 ; Dulcimara C. Nannetti 2 ; Luis Gustavo M. dos Santos 2 ; Duanny Tais R. Caproni 3 ; Felipe Melo 3 RESUMO O grande problema da propagação in vitro de Olea europaea L. é a oxidação. In vitro a oliveira libera exsudatos derivados da oxidação de compostos fenólicos, que são oxidados pelas enzimas polifenases, produzindo substâncias tóxicas, inibindo o crescimento dos explantes, podendo levar a morte, além de escurecer o meio de cultura. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência dos antioxidantes carvão ativo e ácido ascórbico combinados com o meios de cultura MO e WPM. INTRODUÇÃO A oliveira é conhecida cientificamente como Olea europaea L., pertence à família Oleaceae, que compreende espécies de plantas distribuídas pelas regiões tropicais e temperadas do mundo (CORRÊA et al., 2002; OLIVEIRA e ABRAHÃO, 2006). Existem cerca de 35 espécies do gênero Olea. A Olea europaea L. é a única espécie da família Oleaceae com frutos comestíveis. De seus frutos, as azeitonas, os homens no final do período neolítico aprenderam a extrair o azeite. Dentre os diferentes tipos de alimentos o azeite de oliva é considerado como a opção mais saudável entre os azeites comestíveis. O cultivo de oliveiras adquiriu especial relevância em todo o mundo, pelo fato de o azeite de oliva ser benéfico à saúde humana, pela sua comprovada eficácia na proteção de enfermidades cardiovasculares e por ser muito utilizado como veículo na confecção de produtos farmacêuticos (AWAN et al., 2003; PIO et al., 2005). A obtenção de mudas de 1 Graduanda em Agronomia, Instituto Federal de Educação, Ciências e Tecnologia do Sul de Minas Gerais (IFSULDEMINAS) - Câmpus Machado - Bolsista IC CNPq 2 Professor (a) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais (IFSULDEMINAS) - Câmpus Machado 3 Graduando(a) em Agronomia, Instituto Federal de Educação, Ciências e Tecnologia do Sul de Minas Gerais (IFSULDEMINAS) - Câmpus Machado

2 qualidade, além de garantir uniformidade e origem varietal, é um fator que influencia toda a vida do pomar, permitindo maximizar os efeitos de clima e de solo e, principalmente, de tratos culturais adotados para a cultura. Recentemente, tem-se trabalhado com micropropagação de células, buscando obter as vantagens que esta técnica pode oferecer. Apesar dos frutos da oliveira possuírem sementes viáveis, a reprodução sexual não é desejada no estabelecimento de plantios comerciais, em razão das plantas obtidas serem distintas da planta-mãe (elevada variabilidade genética) e apresentarem longo período juvenil. Sendo assim, a micropropagação in vitro é a técnica viável para o processo de formação de mudas, mantendo, assim, as características genéticas das plantas-matrizes, uniformidade, porte reduzido e precocidade de produção e acelerando os métodos de propagação convencional sendo uma alternativa para os produtores. Dentre as técnicas de Cultura de Tecidos Vegetais, a micropropagação de espécies lenhosas vem sendo estudada há várias décadas e tem como objetivo básico o estabelecimento de uma metodologia de multiplicação clonal de indivíduos superiores ou tão somente a multiplicação em maior escala de mudas idênticas (TORRES et al., 1998). Um dos aspectos fundamentais a considerar no momento da propagação de plantas, em especial da oliveira, é garantir a autenticidade varietal, assim como a sanidade e a produtividade. No entanto, o grande problema da multiplicação por esta tecnologia é a oxidação da oliveira in vitro, devido aos compostos fenólicos. Por ser uma espécie lenhosa, ao ser cultivado in vitro, a oliveira libera exsudatos derivados da oxidação de compostos fenólicos, sendo necessária a aplicação no meio de cultura de antioxidantes. A oxidação ocorre em função da liberação de compostos fenólicos in vitro, precursores da síntese de lignina, pelo tecido injuriado. Esse acúmulo de polifenóis e produtos de oxidação, como melanina, suberina, lignina, cutina e calose em torno da superfície excisada, modificam a composição do meio de cultivo e a absorção de metabólitos (ANDRADE et al., 2000). As plantas perenes lenhosas são consideradas ricas em substâncias derivadas do metabolismo secundário, os quais exercem importante papel no metabolismo destas espécies, bem como na defesa contra predadores e microrganismos. In vitro a oxidação fenólica constitui um dos principais problemas enfrentados no início do estabelecimento e durante o cultivo de explantes destas

3 espécies. Alguns gêneros de plantas são mais suscetíveis à oxidação fenólica que outros e depende igualmente do tipo de explante utilizado. Explantes jovens em geral oxidam menos. Segundo Sato et al. (2001), os compostos fenólicos são oxidados pelas enzimas polifenases, produzindo substâncias tóxicas, inibindo o crescimento dos explantes, podendo causar sua morte, além de escurecer o meio de cultura. Grattapaglia e Machado (1998) recomendam para controlar a oxidação as seguintes medidas: lavagem do material antes da desinfestação em água corrente, auxiliando na lixiviação dos compostos fenólicos; utilização de antioxidantes: ácido ascórbico, polivinilpirrolidone (PVP), carvão ativado e incubação inicial dos explantes no escuro. A atividade das enzimas no que diz respeito à biossíntese e oxidação de fenóis é aumentada pela luz, portanto, o escurecimento dos tecidos poderá ser reduzido e até mesmo impedido, caso os explantes sejam cultivados no escuro por até 14 dias (Davies, 1972, citados por MELO et al., 2001). A oxidação fenólica tem sido controlada em diferentes espécies lenhosas pela redução da intensidade luminosa, pela diminuição na concentração de sais no meio de cultura e notadamente pela adição de antioxidantes ao meio (CALDAS et al.,1998). MATERIAL E MÉTODOS O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biotecnologia do Instituto Federal de Educação e Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais Câmpus Machado. Para o estabelecimento in vitro foram utilizados segmentos nodais com aproximadamente 1 cm de comprimento, obtidos de brotações novas de plantas de oliveira mantidas em campo com idade aproximada de 3 anos. Em laboratório foram retiradas 2/3 das folhas e deixadas 1/3 das folhas próximo ao pecíolo. O material foi deixado em imersão em solução de ácido cítrico na concentração de 0,25 g/l durante 1 hora. Depois foram retirados e desinfestado com imersão em álcool 70% por 30 segundos, seguido de imersão em solução de hipoclorito de sódio (2,5%), adicionado de Tween 20 (três gotas para cada 100 ml de solução), durante 15 minutos. Após este período, o material foi imerso em uma solução de antibiótico Agrimicina e de fungicida Mancozeb na concentração de 1 g/l onde foram colocados no agitador magnético por 2 horas depois lavado por 3 vezes em água destilada previamente autoclavada. Os meios de cultura utilizados foram constituídos pelos

4 sais e pelas vitaminas do meio OM (RUGGINI, 1984), e pelos sais e pelas vitaminas do meio WPM (LLOYD e MCCOWN, 1981). Os meios de cultura foram combinados com antioxidantes carvão ativado (0,5 g/l) e ácido ascórbico (100 mg/l) e o controle sem antioxidante. O ph (5,8) foi ajustado antes da inclusão do Phytagel (0,2%), sendo meio autoclavado a 121 ºC e 1,5 atm por 20 minutos. Foram utilizados tubos de ensaio (20 x 150 mm) com 20 ml de meio de cultura. Após a inoculação, os explantes foram mantidos em sala de crescimento a 25 ± 2 ºC, no escuro, por um período de 14 dias, visando à diminuição de oxidação. Depois desse período, o material foi transferido para luz, em fotoperíodo de 16 horas e 25º C. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com 4 repetições por tratamento, onde cada repetição constituiu de cinco tubos d ensaio, com um explante cada. Foram realizadas avaliações aos 14, 21 e 28 dias quanto à percentagem de explantes oxidados. Para definir as diferenças entre os tratamentos foram feitas análise descritiva. RESULTADOS E DISCUSSÃO Observou-se que todos os tratamentos apresentaram grandes contaminações dos explantes, sendo uma das causas devido aos explantes serem retirados de plantas mantidas em campo, sem nenhum tipo de pulverização preventiva (Fig.1 A e B). No entanto, pode se observar que em todos os tratamentos não houve nenhuma oxidação do meio de cultura (WPM - Woody Plant Medium e OM - Olive Medium). As plantas lenhosas, em que é incluída a maioria das plantas frutíferas, apresentam dificuldades para o estabelecimento in vitro, principalmente devido à contaminação e oxidação. A maior contaminação fúngica também pode ter ocorrido por ainda não ter se estabelecido um protocolo de desinfestação de oliveira para matrizes em campo, indicando que a desinfecção dos explantes com hipoclorito de sódio (2,5%) por 15 minutos não foi suficiente. A baixa taxa de sobrevivência e de estabelecimento também se deve pela alta percentagem de contaminação e não em relação aos meios de cultura utilizados. Em relação os tratamentos o que apresentou menor oxidação foi o tratamento 6 (MO + ácido ascórbico),em relação aos demais como pode ser visto na tabela 1.

5 N de Explante Contaminados Tratamentos Figura 1: Contaminação de explante in vitro avaliado aos 7, 14, 21 dias após a inoculação dos explantes. Tratamentos Pouco Oxidado Oxidado Não Oxidado 7 dias 14 dias 21 dias 7 dias 14 dias 21 dias 7 dias 14 dias 21 dias Tabela 1: Número de explantes de oliveira cultivados in vitro oxidados avaliados aos 7, 14 e 21 dias após a introdução em meio de cultura. Figura 1- A: Segmentos nodais de oliveira inoculados em meio de cultura. B: Segmentos nodais de oliveira contaminados in vitro. CONCLUSÕES Em virtude do alto índice de contaminação fúngica é necessária realização de novo experimento que determine a melhor concentração de hipoclorito para desinfestação de explantes oriundos do campo.

6 Observou se que o tratamento utilizando meio MO + Ácido Ascórbico apresentou menor oxidação dos explantes, sendo assim é necessário um novo teste em relação às doses de ácido ascórbico Agradecimento: CNPq. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRADE, M. W. ; LUZ, J. M. Q.; LACERDA, A. S. Micropropagação da aroeira (Myracroduon urundeuva Fr. All.). Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n.1, p , AWAN, A. A.; IGBAL, A.; JAYED, M.; IDRIS, G. Response of olive hard wood cuttings to different growth media and basal injuries for propagation. Asian Journal of Plant Sciences, v. 2, n. 12, p , CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios nutritivos In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Ed.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-CNPH, p , CORRÊA, M. J. P. et al. Caracterización histoquímica de la etapa temprana del desarrollo del fruto del olivo (Olea europaea L.). Acta Botânica Brasilica, v.16, n.1, p , GRATAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. (Eds.) Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, p MELO, B. de et al. Diferentes antioxidantes no controle da oxidação, germinação e desenvolvimento de plântulas na cultura in vitro de embriões da Guarirobeira [Syagrus oleracea (MART.) BECC.]. Ciênc.agrotec., Lavras, v. 25, n.6, p , nov/dez., OLIVEIRA, A. F.; ABRAHÃO, E. Botânica e morfologia da oliveira (Olea europaea L.). Informe agropecuário, v. 27, n. 231, p , PIO, R.; BASTOS, D. C.; BERTI, A. J.; SCARPANE FILHO, J. A.; MOURÃO FILHO, F. A. A.; ENTELMANN, F. A.; ALVES, A. S. R.; NETO, J. E. B. Enraizamento de diferentes tipos de estacas de oliveira (Olea europaea L.) utilizando ácido indolbutírico. Ciência Agrotecnológica, v. 29, n. 3, p , LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercially feasible micropropagation of montaim laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. Combinet Proceedings International Plant Propagators Society, v. 30, p , RUGINI, E. Somatic embryogenesis and plant regeneration in olive (Olea europaea L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v.14, n.3, p , Jan SATO, A. Y.; DIAS, H. C. T.; ANDRADE, L. A.; et al. Micropropagação de Celtis sp.: controle da contaminação e oxidação. Cerne, Lavras: v. 7, n. 2, p , TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. V. 1 e 2. Brasília SPI/Embrapa CNPH, 2v, 864p.1998.