Influência de Concentrações de Meio MS, Ácido Ascórbico e BAP na Micropropagação de Alecrim-Pimenta (Lippia Sidoides Cham.).

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1 Influência de Concentrações de Meio MS, Ácido Ascórbico e BAP na Micropropagação de Alecrim-Pimenta (Lippia Sidoides Cham.). Aline B. de Mendonça 1 *; Verônica F. Amancio 1 ; Maria de F. Arrigoni-Blank 1 ; Ana da S. Ledo 2 ; Arie F. Blank 1 ; José L. S. de Carvalho Filho 1 ; José W. A. de Paula 1 ; Renato Innecco 3. 1 UFS - Depto. de Eng. Agronômica, Av. Marechal Rondon s/n, São Cristóvão-SE; 2 Embrapa Tabuleiros Costeiros; 3 UFC - Depto. de Fitotecnia. (Apoio: ETENE/FUNDECI/BN, CNPq, FAP- SE) (* Bolsista PIBIC/UFS). RESUMO Avaliou-se o efeito do uso de diferentes concentrações do meio de cultura MS (1,0 MS e 0,5 MS), de ácido ascórbico (0 e 100 mg L -1 ) e do BAP (0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg L -1 ) na regeneração in vitro de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.). Realizou-se dois ensaios, diferindo a origem dos explantes. Os melhores resultados foram obtidos em meio MS e as concentrações de ácido ascórbico e BAP não deram resultados consistentes para o controle da oxidação e número de por explante. Os melhores explantes são obtidos de plantas mantidas em ambiente protegido com tela sombrite 30%. Palavras-chave: Lippia sidoides, contaminação, oxidação, planta medicinal. ABSTRACT Influence of MS medium, ascorbic acid and BAP concentrations on the micropropagation of Lippia sidoides Cham. The effect of different concentrations of MS medium (1,0 MS and 0,5 MS), ascorbic acid (0 e 100 mg L -1 ) and BAP (0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg L -1 ) was evaluated on the in vitro regeneration of Lippia sidoides Cham. Two assays were conducted were the explant source varied. The best results were obtained when full MS medium was used and the concentrations of ascorbic acid and BAP did not resulted in consistent numbers for the oxidation control and number of shoots per explant. The best explants are obtained at plants maintained in environment protected with 30% black screen. Keywords: Lippia sidoides, contamination, oxidation, medicinal plant.

2 Entre as plantas medicinais e aromáticas da Caatinga de maior prioridade a serem conservadas encontra-se Lippia sidoides Cham - Verbenaceae, planta nativa da região do semi-árido do nordeste brasileiro. Sua propagação é através do processo de estaquia, usando de preferência os ramos mais finos (Lorenzi e Matos, 2002), pois até o momento não há relato sobre o encontro de sementes desta espécie (informações dos professores Renato Innecco e Francisco José de Abreu Matos da UFC). Desta forma, faz-se necessário o desenvolvimento de técnicas de propagação in vitro, visando a conservação da sua variabilidade genética. As juntamente com as flores constituem a parte medicinal desta planta. Seu óleo essencial contém mais de 60% de timol ou uma mistura de timol e carvacrol, dois terpenos fenólicos dotados de fortíssima atividade antimicrobiana, anti-séptica, moluscicida e larvicida. Não existem relatos disponíveis de trabalhos na literatura sobre a micropropagação de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.). Assim sendo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência de concentrações do meio de cultura MS, associadas a ação antioxidante do ácido ascórbico e ao regulador de crescimento BAP, na regeneração in vitro desta espécie. MATERIAL E MÉTODOS A produção das mudas foi feita por estaquia, retirando-se as estacas no dia 17/09/2003 das matrizes do Horto de Plantas Medicinais da Fazenda Experimental Campus Rural da UFS, localizado no município de São Cristóvão-SE. As estacas foram plantadas em bandeja de poliestireno com 72 alvéolos, utilizando-se o substrato terra vegetal + esterco bovino + biofertilizante Vitasolo, na proporção de 1:1:1, em volume, e colocadas em ambiente protegido com tela sombrite 30%, com irrigação por aspersão. Após 70 dias, as mudas foram transplantadas para vasos de 5,5 litros com o substrato acima citado e mantidas na mesma estufa agrícola. Dois dias antes da retirada dos explantes as plantas foram pulverizadas com uma solução de Benomyl a 2 g L -1. Os ensaios foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais e Melhoramento Vegetal do Departamento de Engenharia Agronômica (DEA) da Universidade Federal de Sergipe (UFS), localizado no município de São Cristóvão-SE, Brasil. Os explantes foram coletados no período da manhã (entre seis e sete horas), a fim de obter um perfeito estado de hidratação, e colocado num frasco com água destilada. No laboratório, foram lavados em água corrente durante uma hora, enquanto retirava-se o excesso de lâminas foliares. Em seguida, os segmentos nodais foram colocados em um recipiente com 10 gotas de detergente por litro de água, durante 10 minutos, com agitação e,

3 posteriormente, lavados três vezes com água destilada para remoção do detergente. Na sala de inoculação, os segmentos foram colocados em álcool etílico 70% durante 30 segundos e, em seguida, lavados três vezes com água destilada e autoclavada para assim receberam os tratamentos. Passado o tempo do tratamento, os recipientes com as soluções foram levados à câmara de fluxo laminar, onde os segmentos foram lavados três vezes com água destilada e autoclavada. Em seguida, com o auxílio de um bisturi e uma pinça, constantemente flambados, os explantes foram seccionados com cerca de 10 a 15 mm de comprimento e inoculados em frascos com tampa antifúngica, contendo 25 ml do meio básico Murashige e Skoog (MS) (Murashige e Skoog, 1962). O meio de cultivo utilizado foi composto do meio de cultura básico MS estabelecido por Murashige e Skoog (1962), acrescido de 30 g L -1 de sacarose e 7 g L -1 de ágar. O ph do meio foi ajustado para 5,7 + 1, solidificado com ágar e submetido a autoclavagem por 15 minutos a uma temperatura de o C e pressão de 1,05 atm. Os frascos de 250 ml com os explantes foram mantidos em sala de crescimento com temperatura controlada de o C, fotoperíodo de 16 horas de luz e intensidade luminosa de 30 mol m -2 s -1. Implantou-se dois ensaios para avaliar o efeito de diferentes concentrações de meio de cultura, acrescidos de ácido ascórbico e 6-benzilaminopurina (BAP), buscando o controle da oxidação e desenvolvimento das. No ensaio 1 utilizou-se explantes oriundos de plantas matrizes em campo aberto e no ensaio 2 foram usados explantes oriundos de plantas mantidas em ambiente protegido com tela sombrite 30%. O delineamento experimental dos ensaios foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 2 x 4, com três repetições. Avaliou-se o efeito de duas concentrações do meio MS (0,5 e 1 MS), duas concentrações de ácido ascórbico (0 e 100 mg L -1 ) e quatro concentrações de BAP (0, 1, 2 e 3 mg L -1 ). Cada repetição foi constituída de um frasco, contendo três explantes. Aos 30 dias após implantação do ensaio, avaliou-se as variáveis contaminação, oxidação, número de e número de. Realizaram-se análises de variância e teste de Tukey (P < 0,05). RESULTADOS E DISCUSSÃO Ensaio 1: Na Tabela 1, apesar das variáveis avaliadas não terem sofrido influência significativa das concentrações de meio de cultura MS, na concentração de MS completo foram observadas as maiores médias de número total de e de e número de. As concentrações de ácido ascórbico não influenciaram as variáveis avaliadas (Tabela 2). No entanto, os tratamentos com a presença de ácido ascórbico apresentaram menor valor numérico de porcentagem de oxidação. Corroborando com os resultados acima descritos, Melo et al. (2001), em trabalho com Syagrus oleracea, avaliaram

4 diferentes antioxidantes no controle da oxidação e observaram que o meio MS acrescido de 100 mg L -1 de ácido ascórbico resultou em apenas 3,37% de oxidação. Com isso, torna-se necessária a implantação de novos ensaios a fim de testar outros antioxidantes e provavelmente outras concentrações do ácido ascórbico. Com relação a concentração de BAP, observou-se que somente a variável contaminação apresentou diferenças significativas, sendo a concentração de 0,5 mg L -1 a que proporcionou uma menor contaminação (Tabela 3). As demais variáveis analisadas não apresentaram diferenças significativas, apesar de numericamente haver uma tendência benéfica para a concentração de 1,0 mg L -1 para as variáveis número total de e de e número de. TABELA 1., contaminação, número total de, número total de e número de de explantes de alecrim-pimenta (L. sidoides), em função das concentrações de meio de cultura MS. São Cristóvão, UFS, 2004.* Meio de Cultura N o de 1,0 MS 76,389 a 55,556 a 0,292 a 1,208 a 0,917 a 0,5 MS 84,722 a 66,666 a 0,083 a 0,250 a 0,125 a * Valores com letras iguais, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de F (P < 0,05). TABELA 2., contaminação, número total de, número total de e número de de explantes de alecrim-pimenta (L. sidoides), em função das concentrações de ácido ascórbico. São Cristóvão, UFS, 2004.* Ácido Ascórbico (mg L -1 ) N o de 0 83,334 a 65,278 a 0,208 a 0,833 a 0,417 a ,778 a 56,944 a 0,167 a 0,625 a 0,625 a * Valores com letras iguais, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de F (P < 0,05). TABELA 3., contaminação, número total de, número total de e número de de explantes de alecrim-pimenta (L. sidoides), em função das concentrações de BAP. São Cristóvão, UFS, 2004.* BAP (mg L -1 ) N o de 0 86,112 a 77,778 a 0,083 a 0,250 a 0,250 a 0,5 86,112 a 41,666 b 0,250 a 0,750 a 0,500 a 1,0 77,777 a 55,555 ab 0,333 a 1,667 a 1,083 a 2,0 72,222 a 69,445 ab 0,083 a 0,250 a 0,250 a * Valores com letras iguais, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P < 0,05).

5 Ensaio 2: O meio de cultura MS, contendo metade dos sais proporcionou uma contaminação de 79% contra 43% do MS completo (Tabela 4). Este resultado pode ser explicado pelo fato de que o meio MS completo proporcionou a quantidade de nutrientes necessários para um bom desenvolvimento dos explantes, impedindo a proliferação dos microorganismos. Em relação ao ácido ascórbico não houve diferença significativa entre os tratamentos (Tabela 4). Comparando-se a procedência dos explantes, observa-se que os oriundos de matrizes em campo aberto proporcionaram numericamente maior contaminação e oxidação em explantes inoculados em meio MS completo (Tabela 1), possivelmente em virtude dos explantes serem provenientes de plantas cultivadas em ambiente protegido com tela sombrite 30%. Estas plantas por estarem em ambiente com baixa luminosidade sofrem menos problemas de oxidação, já que as enzimas da oxidação são estimuladas na presença de luz. Analisando as concentrações do meio de cultura dentro da interação meio de cultura x ácido ascórbico, a utilização de metade dos sais do MS, proporcionou uma menor porcentagem de oxidação na ausência do ácido ascórbico. Entretanto, para as variáveis número total de e de e número de, a adição de 100 mg L -1 de ácido ascórbico foi prejudicial, não permitindo o desenvolvimento dos explantes (Tabela 5). Em relação ao ácido ascórbico, nota-se que a utilização de 100 mg L -1 ao meio MS completo favoreceu um maior número total de e número de por brotação (Tabela 5). Estes resultados indicam que, no meio MS completo, a presença de 100 mg L -1 de ácido ascórbico teve uma resposta benéfica no desenvolvimento da parte aérea dos explantes quando comparado com a ausência deste antioxidante. Com relação ao BAP, não houve diferenças significativas entre as diferentes concentrações para todas as variáveis avaliadas. Em termos numéricos, houve uma tendência de melhoria quando se utilizou a concentração de 2,0 mg L -1 para praticamente todas as variáveis analisadas (Tabela 6). Flores et al. (1998), em ensaio testando diferentes citocininas, obtiveram 59,7% de indução de utilizando 2,0 mg L -1 de BAP e 42,7% de regeneração em presença de BAP nos explantes provenientes de segmentos nodais e apicais.

6 TABELA 4. Valores médios de contaminação de explantes de alecrim-pimenta (L. sidoides), em função das concentrações de meio de cultura e ácido ascórbico. São Cristóvão, UFS, Meio de Cultura** 1,0 MS 43,056 b 0,5 MS 79,167 a Ácido Ascórbico (mg L -1 )* 0 54,167 a ,057 a * Valores com letras iguais, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de F (P < 0,05); ** teste de F (p < 0,01). TABELA 5. Valores médios de oxidação de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.), em função da interação meio de cultivo e ácido ascórbico. São Cristóvão, UFS, 2004.* Meio de Cultura Ácido Ascórbico (mg L -1 ) * N o de * N o de * N o de ** 1,0 MS 88,89 a A 72,22 a A 0,17 a A 1,00 a A 0,50 a B 5,33 a A 0,25 a B 1,90 a A 0,5 MS 44,44 b B 80,56 a A 0,50 a A 0,00 b A 2,67 a A 0,00 b A 1,33 a A 0,00 b A * Valores com letras iguais, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem entre si pelo teste de F (P < 0,05); ** (P < 0,01). TABELA 6., contaminação, número total de, número total de e número de de explantes de alecrim-pimenta (L. sidoides), em função das concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) testadas. São Cristóvão, UFS, 2004.* BAP (mg L -1 ) N o de 0 80,556 a 55,556 a 0,333 a 2,167 a 0,483 a 0,5 61,112 a 69,446 a 0,500 a 3,000 a 1,583 a 1,0 75,000 a 69,445 a 0,000 a 0,000 a 0,000 a 2,0 69,445 a 50,000 a 0,833 a 3,333 a 1,417 a * Valores com letras iguais, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P 0,05). LITERATURA CITADA FLORES, R.; STEFANELLO, S.; FRANCO, E.T.H.; MANTOVANI, N. Regeneração in vitro de espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart.). Revista Brasileira de Agrociência, v.4, n.3, p , LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil; nativas e exóticas. Nova Odessa: Instituto Plantarum, p. MELO, B. de; PINTO, J.E.B.P.; LUZ, J.M.Q.; PEIXOTO, J.R.; JULIATTI, F.C. Diferentes antioxidantes no controle da oxidação, germinação e desenvolvimento das plântulas na cultura in vitro de embriões da guarirobeira [Syagrus oleracea (Mart.) Becc.]. Ciência e Agrotecnologia, v.25, n.6, p , MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassys with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, v.15, p , 1962.

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