- Extração de DNA e RNA. - Reação de Cadeia de Polimerase (PCR) - Marcadores Moleculares

Transcrição

1 - Extração de DNA e RNA - Reação de Cadeia de Polimerase (PCR) - Marcadores Moleculares

2 Coleta de insetos

3 Coleta de insetos

4 Procedimentos de coleta e conservação Como coletar? Métodos variáveis O que coletar? Insetos inteiros, parte do corpo e diferentes fases de vida Perguntas específicas Como transportar? Integridade do DNA e evitar contaminantes

5 Procedimentos de coleta e conservação Conservação DNA Métodos variáveis Oliveira et al., 2002 (Neotropical Entomology, 31, )

6 Procedimentos de coleta e conservação Conservação RNA Rápida degradação Criolifilização (retirada da água) em solução de FORMAzol RNAlater Storage Solution

7 Procedimentos de coleta e conservação Etiquetas e cadernos de atas (Inseto e DNA) Coletor Local Hospedeiro Data Número de depósito Estádio de vida Outras informações * Canetas permanentes, etiquetas a prova d água

8 Extração O objetivo de qualquer protocolo de extração consiste em obter DNA/RNA de alta qualidade, em quantidade, de forma rápida e eficiente Os protocolos de extração devem evitar a degradação do DNA/RNA pelas DNAases e RNAases, isolar e purificar, separando-os efetivamente dos outros constituintes celulares. No caso especial dos ácidos nucléicos, também é fundamental manter a integridade das moléculas, que devem permanecer inalteradas durante o procedimento de extração, pois as informações contidas tanto no DNA quanto no RNA dependem da sua sequência Eliminar os polissacarídeos e lipídeos que inibem a ação de enzimas importante no processamento da amostra Eliminar as substâncias fenólicas ou outros compostos secundários que podem danificar o DNA/RNA durante o armazenamento

9 Extração Vários métodos - Kits de extração - Métodos padrões

10 Extração de DNA Kits de extração 1) Macerar o inseto com N líquido; (Quanto de tecido macerar?) 2) Adicionar 180 µl de tampão ATL e triturar novamente se necessário; 3) Adicionar 40 µl de proteinase K. Misturar, homogeneizar em vortex e colocar em banho-maria a 55 C por uma noite; 4) Homogeneizar no vortex por 15 s e adicionar 200 µl de tampão AL (lise). Homogeneizar e colocar em banho-maria a 70 C por 10 min; 5) Adicionar 200 µl de etanol (95-100%) e homogeneizar em vortex; 6) Pipetar toda a mistura do eppendorf e transferir para mini coluna. Centrifugar a 8000 rpm por 1 min. Descartar o líquido e transferir para outro eppendorf de 2 ml; 7) Adicionar 500 µl de tampão AW1. Centrifugar a 8000 rpm por 1 min. Descartar o líquido e transferir para outro eppendorf de 2 ml; 8) Adicionar 500 µl de tampão AW2. Centrifugar a rpm por 3 min. Centrifugar a 8000 rpm por 1 min sem solução para secar. 9) Adicionar 50 µl de tampão AE diretamente na membrana. Incubar em temperatura ambiente por 30 min. Centrifugar a 8000 rpm por 1 min; 10) Deixar 24 h na geladeira e depois congelar a -20 C.

11 Métodos Padrões 1) macerar individualmente em nitrogênio líquido 2) acrescentar 500µL de tampão CTAB (100mM de Tris-HCl, Ph 8,0; 1,4M de NaCl; 0,02M de EDTA, ph 8,0; CTAB (2%) e β-mercaptoetanol (0,2%, adicionado separado dos demais componentes do tampão), macerando novamente. 3) Posteriormente adiciona-se 6µL de proteinase K (50 mg/ml). Agitar no vortex e incubadas a 65 C em banho-maria por 1,5 h. 4) Após a incubação adiciona-se 17µL de RNAse A (50 mg/ml), seguida por nova agitação e incubação a 37 C por 2,5 h. 5) Posteriormente as amostras são centrifugadas por 5 min à rpm e o sobrenadante transferido para um novo tubo. 6) Ao sobrenadante é adicionado uma alíquota de 500µL de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1 v/v), seguindo-se de uma centrifugação à rpm por 15 min. 7) Novamente transfere-se o sobrenadante para um novo tubo e adiciona-se 500µL de isopropanol deixando o mesmo precipitar á 4 C por uma noite. 8) Após a incubação, as amostras foram centrifugadas por 12 min à rpm, descartando-se o sobrenadante. Efetua-se duas lavagens com 500µL de etanol 70% e etanol 95% respectivamente. 9) Após a secagem em temperatura ambiente do pellet, este é ressuspendido em 50µL de tampão TE 0,1M (10mM Tris-HCl; 1mM EDTA, ph 8,0) por uma noite a 4 C, posteriormente este é estocado a -20 C.

12 Reagentes e funções Extração de DNA Tampão: Manutenção do ph, detergentes e quebra de proteínas. Tris-HCl: estabilização do ph (8,0) impedindo a ação de DNAases NaCl: desestabiliza a membrana celular e liga-se ao DNA neutralizando-o e ajudando na futura precipitação EDTA: desestabiliza a membrana celular (afinidade Mg 2+ e Ca 2+ ) e ação de enzimas como as proteases e DNAases CTAB: detergente catiônico, ajudam na solubilização de polissacarídeos e lipídeos β-mercaptoetanol: desnaturação de proteínas e eliminação de polifenóis desnaturantes

13 Extração de DNA Reagentes e funções Proteinase K: facilitar a separação do DNA das proteínas da cromatina RNAase A: Degradação do RNA total Clorofórmio: promove a extração de lipídios, proteínas e polissacarídeos, que são dissolvidos nesse solvente orgânico (inferior), enquanto o DNA permanece na fase aquosa (superior), fases estas separadas após centrifugação Álcool Isoamílico: Evita espumas durante a agitação com o clorofórmio Isopropanol: Precipitação do DNA TE (10mM Tris-HCl; 1mM EDTA, ph 8,0): Proteção do DNA durante o armazenamento

14 Reagentes e funções Outros componentes: Extração de DNA Fenol: similar proteinase K; Sais como 7,5 M de Acetato de sódio (alta concentração): Precipita RNA (age similar RNAase); PVP, PVPP ou soroalbumina bovina (BSA): eliminação de polissacarídeos

15 Extração de RNA Protocolo TRIZOL Macerar individualmente em nitrogênio líquido Adicionar 1 ml de TRIZOL (TRIZOL gelado e amostras no gelo o tempo todo!) e incubar 7 minutos. Adicionar 200 ul de clorofórmio e agitar vigorosamente com a mão, por 15 segundos, incubar de 2 a 3 minutos e centrifugar a rpm 15 minutos. Transferir a fase aquosa (incolor) para novo tubo, evitando tocar na interface. Adicionar 500 ul de álcool isopropílico e agitar por inversão gentilmente; Incubar 10 minutos e centrifugar a rpm, 10 minutos. Cuidar localização do pellet. Desprezar o sobrenadante; Adicionar 1 ml de álcool etílico 75%. Agitar no vórtex e centrifugar a rpm por 5 minutos. Remover o sobrenadante e deixar o pellet secar, a TA (cerca de 10 minutos). Dissolver em água tratada com DEPC e autoclavada ou com água para injetar.

16 Gel de agarose Quantificação do DNA A agarose é um polissacarídeo e forma uma rede que prende as moléculas durante a migração Gel de agarose 0,8 2,5% Agarose em pó + tampão (TBE 1X) + brometo de metila (1µL de brometo para 50mL de gel) Corrida em TBE (TBE 1X)

17 Quantificação do DNA

18 Gel de agarose Quantificação do DNA Sistema de fotodocumentação

19 Quantificação do DNA RNA DNA degradado DNA sujo (proteínas)

20 Quantificação do DNA DNA de alta qualidade

21 Quantificação do RNA Gel de agarose desnaturante G0 Gp F0 F p DNA RNA 28S RNA 18S RNA 5.8S mrna RNA mensageiro (nuvens) Gel de agarose 1,5% com 1 µl brometo de etídeo (10 mg/ml)

22 Nanodrop Quantificação do DNA/RNA Absorbância (260/280)

23 Bioanalyser Quantificação do RNA

24 Histórico Reação de Polimerase em Cadeia Kornberg (1960) Isolou e caracterizou a DNA polimerase, possibilitando o desenvolvimento da síntese in vitro de cadeias de DNA Karl Mullis (1983) Técnica de PCR polymerase chain reaction possibilita a amplificação in vitro de ácidos nucléicos Karl Mullis (1987) Patenteou a técnica e vendeu para a empresa Hoffmann-La Roche em 1991

25 Reação de Polimerase em Cadeia Kary Mullis 1983 (Prêmio Nobel 1993)

26 Reação de Polimerase em Cadeia Princípios Síntese enzimática in vitro de cópias de DNA a partir da sequencia alvo; A especificidade é dada pelo uso de primers (iniciadores) específicos para o gene ou região do DNA de interesse; A utilização de dois primers de DNA delimitam o alvo e a repetição dos ciclos da PCR dá origem a bilhões de cópias do alvo. Uma DNA polimerase resiste a temperatura, a Taq polimerase, da bactéria Thermus aquaticus é usada para catalisar o crescimento a partir de primers de DNA.

27 Reação de Polimerase em Cadeia Componentes da reação Tampão: manutenção do ph e fornecimento de íons Primers (F e R): iniciadores da DNA polimerase dntps: substrato (A, T, C e G) Mg 2+ : cofator da taq DNA polimerase Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus): Extensão da cadeia de nucleotídeo DNA da espécie-alvo

28 Reação de Polimerase em Cadeia Equipamento Pipetas de precisão extremamente equilibradas Termociclador

29 25-40 X Reação de Polimerase em Cadeia Termociclador Desnaturação inicial: 92 a 95 C (1min - 5min) Desnaturação: 92 a 95 C (30s 1min) Anelamento: temperatura dependente dos primers (30s 2 min) Extensão: 72 C (1min 2min) Extensão final: Na mesma temperatura da etapa 3 (5 20 min)

30 Reação de Polimerase em Cadeia

31 Reação de Polimerase em Cadeia N de ciclos N de cópias

32 Reação de Polimerase em Cadeia

33 Marcadores Moleculares São sequencias de DNA ou proteínas que apresentam polimorfismo e podem ser usadas como indicadores da ampla variação do genoma Mutações Transição: Envolve mudança entre purinas (A e G) ou entre pirimidinas (T e C) Transversão: Envolve mudança entre purinas (A ou G) e pirimidinas (T ou C) Inserção / Deleção (Indels): ocorre pela adição / remoção de um ou mais nucleotídeos na sequência de DNA

34 Marcadores Moleculares São sequencias de DNA ou proteínas que apresentam polimorfismo e podem ser usadas como indicadores da ampla variação do genoma - Marcadores genéticos são unidades herdáveis - Quando o comportamento do marcador segue as leis de herança de Mendel (quando analisando o seu comportamento em uma população segregante), ele pode adicionalmente ser definido como um marcador genético.

35 Marcadores Moleculares Histórico Genética de Mendel - Mendel obteve suas conclusões avaliando fenótipos! - Os marcadores moleculares permite obter as conclusões de Mendel a partir de genótipos (com possibilidade de identificar heterozigotos) - O ambiente é um fator que influencia os fenótipos

36 Marcadores Moleculares Genótipo: é todo o conjunto de genes que um organismo possui; Fenótipo: São todas as características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e comportamentais expressadas por um indivíduo; Um fenótipo não é necessariamente adquirido por uma simples herança mendeliana; Plasticidade Fenotípica: é a habilidade do genótipo do indivíduo responder a influencias ambientais gerando diferentes fenótipos.

37 Marcadores Moleculares São sequencias de DNA ou proteínas que apresentam polimorfismo e podem ser usadas como indicadores da ampla variação do genoma São baseados no fato de que o material genético é transmitido de pais para a prole - assim podemos calcular a relação genética entre indivíduos utilizando dados de genes (ou de fragmentos destes); heranças; - mas para isso precisamos entender os diferentes modos de

38 Marcadores Moleculares Herança dos diferentes genomas e cromossomos - Nuclear Organismos diploides e reprodução sexuada: Herança biparental (um alelo/cromossomo da mãe + outro alelo/cromossomo do pai) cromossomos diploides Herança ligada ao sexo - Maioria dos insetos: fêmeas homogaméticas XX machos heterogaméticas XY - Lepidópteros: fêmeas são heterogaméticas ZW machos homogaméticas ZZ

39 Marcadores Moleculares Herança dos diferentes genomas e cromossomos - Nuclear Organismos diploides e reprodução assexuada (partenogênese): Apomexia (partenogênese mitótica): todo o material genético da mãe Ex.: Afídeos e lepidópteros Amphimixia (partenogênese meiótica): metade do material genético da mãe Ex.: Machos de abelhas e outros himenópteros

40 Marcadores Moleculares Herança dos diferentes genomas e cromossomos - Mitocondrial Organismos diploides e reprodução sexuada/assexuada : Herança materna Cuidado com numts: cópias nucleares de genes mitocôndrias (pseudogenes)

41 Marcadores Moleculares Herança dos diferentes genomas e cromossomos - Simbiontes Celulares (Primários e secundários): Origem materna (transmissão vertical) Transmissão horizontal Outros Herança diversa

42 Marcadores Moleculares Principais marcadores moleculares Isoenzimas Endonucleases de restrição e ligases (enzimas de suporte) Sequenciamento cdna e Clonagem (técnicas de suporte - não são considerados marcadores moleculares) RAPD, RFLP e AFLP (técnicas em desuso) PCR-RFLP ou CAPS Microssatélites Marcadores baseados em plataformas de sequenciamento de nova geração - SNP - RNAseq - EST-SSR

43 Endonucleases de restrição Enzimas ou endonucleases de restrição são enzimas capazes de digerir sequências específicas de DNA dupla fita (catalisam a quebra da ligação fosfodiester), de 4 a 8 pb de comprimento (tesouras moleculares) Endonuclease de restrição foram isoladas de bactérias (sistema de restrição-modificação) Eco RV endonuclease 5 GATATC 3 3 CTATAG 5

44 Endonucleases de restrição Ex. Escherichia coli RY13 (Eco RI) Ordem de identificação ou caracterização (E) - Primeira letra maiúscula corresponde ao nome do gênero (co) - Segunda e terceira letra minúsculas correspondem as duas primeiras letras do nome da espécie (R) Estirpe do organismo

45 Endonucleases de restrição Tipos de corte das endonucleases de restrição Cortes que produzem extremos cegos (blunt ends)

46 Endonucleases de restrição Tipos de corte das endonucleases de restrição Cortes que produzem extremos coesivos (sticky ends)

47 Endonucleases de restrição

48 Endonucleases de restrição Existem 3805 enzimas de restrição caracterizadas bioquimicamente ou geneticamente 611 estão disponíveis comercialmente, incluindo 262 especificidades distintas Pesquisa:

49 Ligases São enzimas possui a capacidade de facilitar ligação de duplas fitas de DNA que possuem extremidades livres (catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster entre grupos 3'- OH e 5'- PO4-, unindo covalentemente moléculas de DNA de fita dupla) T4 DNA ligase E. coli DNA ligase

50 Isoenzimas As isoenzimas são diferentes formas moleculares de uma enzima catalisando a mesma reação na célula Marcadores fenotípicos

51 Isoenzimas

52 Sequenciamento Sequenciamento (meados dos anos 70 e 80) Técnica de interrupção da sequência pela incorporação aleatória de um nucleotídeo modificado (sem a hidroxila na posição 3 ), que ficou conhecida como técnica de didesoxi ou dideoxi. ddntps (didesoxinucleotídeo trifosfasto) permitiu o desenvolvimento de sequenciadores automáticos de DNA

53 Sequenciamento

54

55 Sequenciamento Reações de sequenciamento (componentes similares a reação de PCR) com ddntps fluorescente

56 Sequenciamento Os fragmentos de diferentes comprimentos migram no gel, os menores na frente. São iluminados por um feixe de laser e fluorescem quando atravessam a janela do feixe. Os géis têm sido substituídos por capilares preenchidos de polímero nas máquinas mais modernas. O número de fragmentos gerados é muito grande e a probabilidade de uma classe de tamanho não ser representada na reação é praticamente nula.

57 Sequenciamento

58 Sequenciamento Filogenia Filogeografia Demografia Genes adaptativos

59 Clonagem CLONAGEM: é multiplicar assexuadamente Clonagem de genes é essencialmente o processo de amplificar seletivamente um gene particular, incorporando-o numa bactéria e clonando a bactéria Fragmento alvo (gene específico ou genoma) Vetor plasmídeo ou fago Enzima de restrição corte frequente DNA ligase: possui a capacidade de facilitar ligação de duplas fitas de DNA que possuem extremidades livres

60 Clonagem Os vetores : Plasmídeos Pequenas moléculas circulares de DNA dupla fita, não incorporadas ao genoma das bactéria São formas autoreplicativas de DNA Todos os plasmídeos usados como vetor devem ter: REPLICATOR ou origem de replicação Marcador de seletividade Sítio de clonagem

61 Clonagem

62 Clonagem Que tipo de fragmento de DNA podemos inserir em um vetor: O DNA a ser inserido tem que ser dupla-fita. Enzimas de restrição só cortam DNA dupla-fita. O fragmento de DNA pode ser : cdnas sintetizados as partir de mrnas Produto de digestão de DNA genômico com endonucleases de restrição Produto de PCR DNA dupla fita de qualquer origem

63 Clonagem Etapas 1 - Digestão do DNA alvo com enzima de restrição: os fragmentos de DNA a serem clonados são cortados com as mesmas enzimas utilizadas para linearizar (abrir) o vetor 2 - Reação utilizando a ligase para inserção do fragmento de interesse dentro do plasmídeo

64 Clonagem Etapas 3 - Inserção do plasmídeo recombinante dentro da bactéria quimicamente modificada célula competente (transformação) - Choque térmico (bactérias tornadas competentes ) - Eletroporação (bactérias normais, em meio de baixa força iônica) 4 Seleção (marcador de seletividade) - Resistência a antibióticos - alfa complementação do gene da betagalactosidase (colônias azuis ou brancas

65 Clonagem Repressão removida por IPTG A inserção do DNA a ser clonado interrompe a sequência do LacZ puc plasmid - genérico

66 Clonagem Vetor Clonagem Transformação e Seleção Meio de cultura para o crescimento das bacterias e consequente replicação dos plasmídeos e do DNA alvo Meio LB + amp + X-gal + IPTG PCR Seleciona as colonias individualizadas e de coloração branca Purifica o plasmídeo e sequenciamento

67 cdna DNA complementar DNA complementar (cdna) é o DNA sintetizado a partir de uma molécula de RNA mensageiro Após isolar um mrna, é inserido um primer que utiliza a cauda poly A para se ancorar e a enzima transcriptase reversa sintetize uma fita complementar de DNA a partir do molde de RNA, gerando um hibrido complementar e antiparalelo. O RNA, por ser mais instável irá se degradar permanecendo apenas a fita de DNA que através do PCR poderá ser duplicada e amplificada para estudo.

68 cdna

69 cdna

70 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) Amplifica sequências anônimas de DNA usando primers arbitrários 10 bases com >50% G+C PCR com um único primer Método rápido para detecção de polimorfismos Marcador dominante Problemas de reprodutibilidade

71 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)

72 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) AA AA Aa aa Aa aa

73 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) Trogoderma spp

74 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) Em pleno desuso Baixa reprodutibilidade Problemas de interpretação Revistas já não aceitam trabalhos com marcadores RAPD

75 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Digerir DNA em fragmentos pequenos Separação dos fragmentos por gel eletroforese Transferência de fragmentos de DNA para filtro

76 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Visualização dos fragmentos de DNA sondas marcadas (32P) ou a frio, construídas a partir de bibliotecas de cdna Análise dos resultados bandas analisadas para alelos e/ou presença/ausência diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas A escolha de sonda/enzima de restrição é crucial

77 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Digestão de DNA Genômico e Separação em Gel DNA digestão Separação em gel

78 Southern blot RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

79 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Interpretação dos resultados A1A1 A1 A1 A1 A2 A2 A3 A1A2 A2A3 Repetição Sítio de Restrição

80 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Em desuso Caro e laborioso Necessidade de sondas Alta periculosidade Vantagens Expressão codominante (homozigotos e heterozigotos) Não é afetado pelo ambiente Analisa todo o genoma do organismo estudado Número ilimitado de marcadores

81 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) DNA genômico digestão com duas enzimas MseI EcoRI ligação pré-amplificação amplificação seletiva adaptadores MseI EcoRI

82 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) DNA GAATTCCN CTTAAGCN NTTAA NAATT digestão EcoRI ATTCCN GCN NT NAAT MseI ligação ATTCCN TAA GCN NT N AT TA préamplificação primer +1 amplificação primer +3 ATTCCN TAAGCN A ATTCCA TAAGCT AAC NTTA NAAT C GTTA CAAT AAC

83 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

84 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Eletroforese por capilaridade AZUL = picos dos fragmentos de AFLP VERMELHO = marcador de tamanho

85 PCR-RFLP ou CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence ) Marcador locus-específico Produto amplificado por PCR e analisado por RFLP Sequência de banco de dados, clones de cdna ou genômico Codominante PCR específico locus 1 A B A B Digestão com Enzimas Corte freqüente

86 Susceptível Resistente Susceptível PCR-RFLP ou CAPS

87 Sítio de clivagem Sau3AI (S. aureus) PCR-RFLP ou CAPS O resistente terá um fragmento de 60pb e o susceptível 120pb

88 PCR-RFLP ou CAPS RR SS RS 120pb 60pb

89 Microssatélite - SSR São regiões do genoma caracterizadas por uma série de nucleotídeos repetidos em tandem Dinucleotídica: AGCTTAGGCTAGATGCTGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATCTGCCCCTAACCGCTATA Trinucleotídica: AGCTTAGGCTAGATGCTGGATGATGATGATGATGATTCTGCCCCTAACCGCTATA Tetranucleotídica: AGCTTAGGCTAGATGCTGGATAGATAGATAGATAGATATCTGCCCCTAACCGCTAT Pentanucleotídica: AGCTTAGGCTAGATGCTGGATACGATACGATACGATACTCTGCCCCTAACCGCTAT Hexanucleotídica: AGCTTAGGCTAGATGCTGGATACAGATACAGATACATCTGCCCCTAACCGCTATA

90 Microssatélite SSR (Simple Sequence Repeat ) Outras características dos marcadores de microssatélites Multi-alélicos Co-dominantes Distribuídos por todo o genoma Regiões flanqueadoras conservadas Amplificação por PCR Transferibilidade dos primers

91 Microssatélite - SSR O polimorfismo é pelo tamanho do fragmento 100pb 102pb

92 Microssatélite - SSR Devido a alta taxa de erro da DNA polimerase durante a replicação Localizado em regiões não codantes (íntros)

93 Microssatélite - SSR ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG Primer FOR NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN Repetição CA Primer REV

94 Microssatélite - SSR

95 Microssatélite - SSR Genotipagem sequenciador

96 Microssatélite - SSR Locus 1E1 1A1 1B1 Primer Sequences (5-3 ) F: CACCGATATACCTGCCAAAATA R: AAAACGACAGATAGAACCTCGG F: CACCCTGTATATCGAGAGAACAT R: TACAAAATTATCATCGCCCCTC F: TAATGCGACTTGTTTGAGGATG R: ACAACGATTTCTTTATCACCCG Repeat array Size range (bp) N a Brasil 1 Ho/He (GT) /0.66 (TG) /0.63 (GT) /0.52 1D10 F: ACATTCAGGAGTGGTCTTGGTC R: CTCGGGATTAGCCAACAATAGA (ATC) /0.63 3A11 R: CTCCCCTTTGGTGTGATGTAGT (TG) /0.79 F: ATATTAGAGCGGGGCTGGTT 3H6 F: CAAGGAAGTCTGGATAAATGGT R: GTGACCCTCGTGTCTTGGTAGT (TG) /0.73 3G1 F: CCTGGTTTTGTTTGATATGGAG R: TTCTGGTGTGGATGTGAATGTA (CA) /0.56 3G7 F: GTTTCGTGATCCGGTTTTGT R: GCGCTAGCCTGAGGAGAAT (AG) /0.57

97 Microssatélite - SSR

98 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) alterações da sequência de DNA que ocorrem quando um único nucleotídeo (A, T, C, ou G) na sequência do genoma é modificada. Um exemplo de SNP poderia ser a mudança em sequência de DNA: ACGGCTAA a ATGGCTAA, ocorrendo uma mudança da base nitrogenada C para T.

99 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Prospecção de marcadores Sequenciamento de nova geração Expressão gênica

100 Como escolher o marcador molecular?

101 Marcadores baseados em plataformas de sequenciamento de nova geração Plataforma 454 FLX (Roche) Plataforma Solexa da Illumina Plataforma da Applied Biosystems, denominada SOLiD System Heliscope True Single Molecule Sequencing (tsms), da Helicos. Todas as plataformas tem o objetivo de sequenciar centenas de milhares de fragmentos de DNA/RNA simultaneamente, permitindo explorar completamente o genoma e transcriptoma de um individuo.

102 Marcadores baseados em plataformas de sequenciamento de nova geração Princípios básicos - Construção de biblioteca de DNA (DNAseq) e cdna (RNAseq) - Ligação de adaptadores (servirão de bases para o anelamento de primers) - Sequenciamento em larga escala - Comparação com banco de dados (Blastn, Blastx) - Confirmação por sequenciamento ou RT-PCR

103 Representação da plataforma Illumna. Fonte: Carvalho & Silva, Ciência Rural, v.40, O DNA é fragmentado e ligado aos adaptadores A e B (A). Posteriormente é aderido por afinidade ao suporte sólido onde estão oligonucleotídeos complementares aos adaptadores A e B (B). Durante a etapa de anelamento (C), no primeiro ciclo de amplificação da PCR em fase sólida, o adaptador da extremidade livre da molécula aderida ao suporte encontra seu oligonucleotídeo complementar no suporte, formando uma estrutura em ponte. Uma vez fornecidos os reagentes necessários, a PCR é iniciada utilizando a extremidade 3 livre do oligonucleotídeo como primer (D). Na etapa de desnaturação (E), a ponte é desfeita devido à elevação de temperatura. Repete-se a etapa de anelamento (F), formando novas estruturas em ponte e iniciando um novo ciclo de amplificação. Após uma série desses ciclos, serão obtidos clusters de moléculas idênticas ligadas ao suporte (G). Com a incorporação de nucleotídeos terminadores marcados e excitação a laser (H), é gerado sinal, o qual é captado por dispositivo de leitura e interpretado como um dos quatro possíveis nucleotídeos componentes da cadeia (I). O processo de incorporação de nucleotídeo marcado, excitação e leitura é repetido para cada nucleotídeo componente da sequência (J, K). A leitura é feita de forma sequencial, o que permite a montagem da sequência completa de cada cluster (L).

104 DNAseq (Genômica) - DNA-seq é o sequenciamento em larga escala de fragmentos de todo DNA de uma espécie (genoma) - Tem o objetivo de caracterizar completamente a composição nucleotídica das diferentes famílias de genes - Determinar a estrutura gênica de uma espécie - Caracterização dos genes e a diversidade de alelos (famílias e subfamílias) - Encontrar regiões de interesse (mutações) e associá-las a características fenotípicas. - Permitir a construção de marcadores moleculares adaptativos (ou seja sob pressão de seleção)

105 Genotyping by Sequencing (GBS ou RADseq)

106 RNAseq - RNA-seq é uma abordagem recentemente desenvolvida, para analisar o perfil de transcriptoma (expressão gênica). - O transcriptoma é o conjunto completo de transcritos (mrnas) em uma célula, e sua quantidade, para um estágio de desenvolvimento específico ou condição fisiológica. - Para determinar a estrutura transcripcional dos genes (Expressed Sequence Tags EST) - Padrões de splicing e outras modificações pós-traducionais - Quantificar os níveis de mudanças de expressão de cada transcrito - Encontrar micrornas que possuem função reguladora

107 Como escolher o marcador molecular? Disponibilidade do marcador (custo x onerosidade) Dominante ou codominante Potencial de gerar polimorfismo Herança do marcador Qual a sua pergunta?