Técnicas moleculares do Laboratório de Biologia Molecular. MSc. Daniele Portela de Oliveira Prof. Sandra Aidar de Queiroz

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1 Técnicas moleculares do Laboratório de Biologia Molecular MSc. Daniele Portela de Oliveira Prof. Sandra Aidar de Queiroz

2 INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) Gregor Mendel (1865) Foco Gene como unidade fundamental de variação biológica Gregor Mendel (1865) leis da hereditariedade

3 INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) Hugo De Vries et al. (1900) Redescobriram os trabalhos de Mendel e formularam as leis da hereditariedade Friedrich Miescher (1868) Publicou uma nova substância no material nuclear de células chamada de nucleína

4 INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) Walther Flemming (1882) Descobriu o processo de mitose e o comportamento dos cromossomos durante a divisão celular. Phoebus Aaron Theodor Levene (1909) Teoria do tetranucleotídeo repetições monótonas dos nucleotídeos. Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) e Timina (T).

5 INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) Wilhelm L. Johannsen (1909) Chamou de gene a unidade descrita por Mendel. Unidade de transferência de hereditariedade. Thomas Hunt Morgan (1911) Demonstrou que os genes estão arranjados de forma linear nos cromossomos.

6 INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) Frederick Griffith (1928) Evidências sobre o papel do DNA Oswald T. Avery (1944)(esq.) e seus colaboradores Colin MacLeod e Maclyn McCarty demonstraram o princípio transformante proposto por Frederick Griffith em 1928.

7 INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) Linus Pauiling com modelos da estrutura alfa hélice de proteínas, também se dedicou a resolver a estrutura do DNA

8 INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência)

9 Crick Físico e Biólogo. Estudou a estrutura cristalina da hemoglobina Watson Biólogo com tese em Zoologia. Estou o efeito do raio X na multiplicação de vírus que infectam bactérias (Copenhagen). Conheceu Wilkins em Napóles mudou sua pesquisa para difração de DNA 1 Watson e Crick a hélice de DNA era composta por 3 cadeia de nucleotídeos.

10 Peter Filho de Linus Pauling foi fazer doutorado com Kendrew. 2 Watson e Crick perceberam o erro na molécula através do artigo de Pauling e corrigiram. Concluíram que os fosfatos estavam do lado de fora da hélice. Conversas entre Wilkins, Franklin, Watson e Crick concluíram finalmente a estrutura do DNA Crick, Watson e Wilkins (1962) Prêmio Nobel de Medicina ou Fisiologia Estrutura do DNA

11 Watson e Crick(1953) WATSON E CRICK (1953) DNA Estudos de migração, seleção e deriva genética Elucidaram o código universal genético

12 Polimorfismo Definição: Formas alternativas de um mesmo segmento de DNA. Resultado de uma mutação (evento). 1% na população A B

13 Tipos de polimorfismos (marcadores) A) Variação no número de cópias (mini e microssatélites): sequências adjacentes que se repetem em número variado. NÃO OCORRE EM ÉXON Mini x Micro Tamanho da sequência repetitiva (Tandem) Não alteram a proteína

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15 Tipos de polimorfismos (marcadores) B) SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Substituição de um único nucleotídeo A forma de polimorfismo mais abundante no genoma Ocorre em qualquer região Éxon PODE alterar a sequência de aa na proteína (mutação não sinônimo) Anemia falciforme, BLAD, K-caseína(BB)

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17 Tipos de polimorfismos (marcadores) C) Indel In/Del: Inserção/deleção Éxon Efeito deletério por inviabilizar a proteína

18 C) Indel Sequência ampla

19 Utilização dos marcadores Mecanismos de herança mendeliana Humanos, bovinos e suínos Doenças hereditárias Mecanismos relacionados a características complexas (Georges e Anderson, 2003) Essas características são controladas por muitos genes, que podem resultar em complexas interações alélicas e interações não-alélicas, e são influenciadas pelo ambiente.

20 Marcadores moleculares Sequenciamento do genoma Bibliotecas virtuais de várias espécies NCBI-GenBank Site: Seleciona Nucleotide (All databases) Busca Sequência e/ou espécie

21

22 Marcadores moleculares Emprego dos QTL Seleção Assistida por marcadores (MAS) Eliminar animais portadores de alelos deletérios Exemplo: mutação responsável pela síndrome do estresse dos suínos (gene PSS) Exemplo: (BLAD) mutação no gene que codifica a proteína CD18, responsável pela síndrome de deficiência de adesão dos leucócitos (Hol) Exemplo: mutação relacionada a sindactilia dos bovinos

23 Marcadores moleculares Desvantagens do uso da MAS para características quantitativas Emprego do genótipo de um marcador Conduz a rápida fixação de um alelo selecionado Desconsidera o efeito poligênico

24 Marcadores moleculares Vantagens do uso da MAS Características com baixa herdabilidade e difícil mensuração Estudos de expressão gênica RNA Teste de paternidade DNA-fingerprint Variabilidade genética + 2 alelos Parâmetros populacionais Endogamia

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26 Extração de DNA Qualquer procedimento laboratorial envolvendo análise de DNA ou RNA tem que passar pelo processo de extração Em geral, baseia-se em 4 etapas básicas (protocolos de extração) Etapas: 1. Lise das membranas lipídicas 2. Purificação do DNA 3. Precipitação do DNA 4. Reidratação do DNA

27 Extração de DNA 1. Lise das membranas lipídicas a) Membranas: fosfolipídios + proteínas b) Rompimento da membrana celular e dos compartimentos membranosos (organelas) c) Provocada por uma solução detergente

28 Extração de DNA 2) Purificação do DNA a) Remoção de componentes celulares como proteínas, organelas e restos celulares b) Proteinase K Desnaturação das proteínas c) Fenol Remove proteínas e outros contaminantes da solução aquosa d) Clorofórmio ajuda a desnaturar proteínas e remover o fenol residual e) NaCL 2 ajuda a manter a proteínas dissolvidas no líquido extraído, impedem que precipitem

29 Extração de DNA 3) Precipitação do DNA a) DNA é solúvel em água, mas insolúvel em álcool a) Usa-se etanol para precipitar o DNA b) Quanto mais gelado o etanol menos solúvel o DNA vai estar b) Retira-se o álcool para formação do pellet

30 4) Reidratação do DNA Extração de DNA a) Após a retirada do álcool, o DNA precisa se solubilizar em algum solvente: Água ultra-pura ou uma solução Tampão a) Este solvente servirá para armazenamento do DNA extraído b) Deve ser livre de contaminantes e enzimas capazes de destruir o DNA b) Armazenar o DNA a - 20 º C

31 Como PCR funciona? Objetivo Multiplicar um trecho específico do DNA. Como funciona? Alternando a temperatura do ensaio

32 Replicação do DNA

33 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) PCR -> Polymerase Chain Reaction Multiplicação in vitro de um trecho específico de DNA (gene ou parte dele, regiões supervariáveis) resultando na produção de milhares de cópias da sequência desejada sem o uso de um organismo vivo.

34 Breve Histórico Saiki, et al. (1985) desenvolveu a técnica Kary Mullis (1987) inovou Gene β-globina humana Nobel de Química em 1993 Perkin-Elmer Roche Molecular System

35 Breve Histórico Conceito de primer de PCR Taq -> DNA polimerase termoestável isolada da bactéria de fontes termais Thermus aquaticus Temperatura de até > DNA Thermal Cycler (primeiro Termociclador automático)

36 Como PCR funciona? a) desnaturação das cadeias do DNA genômico b) anelamento (annealinng) dos primers, usados para delimitar a sequência a ser amplificada c) temperatura ótima específica da enzima: 72ºC d) reinício do ciclo

37 Como PCR funciona?

38 Como PCR funciona? A quantidade final de DNA segue uma função exponencial: N = N 0. 2n N -> Número final de cadeias de DNA N 0 -> Número inicial de DNA molde (template) n -> Número de repetições do ciclo

39 Componentes da PCR

40 Componentes da PCR DNA molde Extraído de uma amostra (sangue, pelo, sêmen) ou de um RNA, convertida para cdna. Primer Sequência de DNA que serve como ponto de início de replicação. Forward e Reverse. GoTaq (Promega) Taq + Tampão + MgCL 2 + dntp s H 2 O Água ultra pura e livre de cargas elétricas (H2O miliq

41 Tipos de reações de PCR RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction) Parte de uma amostra de RNA. Primer inespecífico. É fundamental nos estudos de expressão gênica. Multiplex PCR Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específico. Testes de paternidade.

42 Primers exon 9 Desenho de Primers FORWARD TAAAGGCAGGAGTAATAAAGTATGTTA CCAAGAAATGTAAGTTTCAGATGTTTAATGACTCATT GTTATCTTCTCACTATTAATTTAGGATGTCTAAACAA GGACGGACAATCATCTTCTCCATTCATCAGCCTCGTT ATTCCATCTTCAAGTTGTTTGATAGCCTCACCTTGTT GGCCTCGGGAAGACTCATGTTCCACGGGCCTGCTCAG GAGGCCTTGGGGTACTTTGGAGCCATAGGTATGGTTG CCTTTTTTGTGCTGTAAGATCCTTCATTAATAGTATC CTAAAGGAGAACAAAGGAGTCACTTGGAGCACTGTTT GATCTTTGAGTAGATATACATATATCACAGTTTCCAC TGCTCCGAAACATCTTCGGTTAGTTTGGTGTTA... REVERSE 3 5 GAAGCCAATCAAACCACAAT

43 Otimizando o PCR Concentração de Mg 2+ na reação Cofator da enzima Tht (Thermus thermophillus) Polimerase Temperatura de anelamento dos primers Gradientes de temperatura no termociclador

44 Otimizando o PCR Gradiente definição da temperatura de anelamento 48,3 49,4 50,5 51,6 52,7 53,8 54,9 56

45 Eletroforese em Gel Função: Separar e as vezes purificar macromoléculas proteínas e ácidos nucléicos diferentes tamanhos, cargas ou conformação. Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para o pólo positivo ou negativo. Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

46 Eletroforese em Gel Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel. O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar e também para manter o ph mais ou menos constante.

47 Eletroforese em Gel Gel composto de agarose ou poliacrilamida Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha. Usada em concentrações de 0,5 a 2% Fácil de preparar Não-tóxico Ampla capacidade de separação de fragmentos Baixa resolução

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50 Eletroforese em Gel Gel composto de agarose ou poliacrilamida Poliacrilamida é um polímero de ligação cruzada de acrilamida. Usada em concentrações de 3,5 a 20%. Difíceis de preparar. Precisam ser montados em placas de vidro Acrilamida é um potente neurotóxico Baixa capacidade de separação de fragmentos Alta resolução

51 Gel de Poliacrilamida

52 Visualização da PCR O tampão da amostra possui uma mistura de corantes: Azul de Bromofenol (Corante) Xileno-Cianol e Glicose (aumentam a viscosidade) Foto de Gel de Poliacrilamida Foto de Gel de Agarose

53 Polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição - RFLP Variação individual no número e no tamanho dos fragmentos formados pela digestão do DNA com uma enzima de restrição.

54 Polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição - RFLP Resultante de mutações pontuais, que eliminam ou criam sítios de restrição para determinada enzima Podem originar eventos de inserção ou de deleção entre dois sítios de restrição adjacentes.

55 Polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição - RFLP Dois indivíduos distintos que têm o DNA extraído e submetido a clivagem por enzima de restrição; Após a extração, o DNA dos indivíduos é tratado com enzima de restrição, que o corta em um grande número de pontos (sítios de restrição), gerando uma enorme quantidade de fragmentos; As diferenças na sequência de DNA dos indivíduos resulta na clivagem de fragmentos de tamanhos distintos, que são separados através de eletroforese em gel de agarose.

56 Técnica de RFLP Consiste na identificação por hibridização do DNA 1- Extração do DNA 2- Digestão por enzimas de restrição 3- Separação dos fragmentos (eletroforese) 4- Transferência do DNA para membrana de nylon (Botstein et al., 1980)

57 Técnica de RFLP 5- Hibridação (fragmentos x sondas marcadas) 6- Autoradiografia (exposição da membrana a filme de raio X ou compostos luminescentes 7- Análise da segregação (Botstein et al., 1980)

58

59 Aplicações do RFLP Diversidade genética Construção de mapas de ligação e Mapeamento de QTLs Seleção assistida por marcadores (SAM)

60 RFLP Limitações Passos intensivos de mão de obra Inexistência de biblioteca de sondas disponível Vantagens Varredura em praticamente todo o genoma Expressão co-dominante (hetero e homozigoto) Alta repetibilidade e consistência

61 Resultados de Genética Molecular Identificação de mistura de leite bovino em leite bubalino por PCR- RFLP/Hae III da β-casein gene (exon VII) A variante bovina B variante bubalina 1 (Índia) C variante bubalina 2 (Brasil) Extração de DNA feita a partir de queijo Otaviano et al, 2008

62 Marcadores moleculares Métodos de análise da estrutura e função do material genético, e de equipamentos de alta capacidade de processamento de amostras, métodos estatísticos e ferramentas de informática, resultando na ciência conhecida como genômica.

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