PROTEASES Enzimas que pertencem ao grupo das hidrolases; Hidrólise das ligações peptídicas das proteínas; Podem apresentar atividade sobre ligações

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2 PROTEASES Enzimas que pertencem ao grupo das hidrolases; Hidrólise das ligações peptídicas das proteínas; Podem apresentar atividade sobre ligações éster e amida; Envolvidas nos processos de digestão, ativação de enzimas, coagulação do sangue etc. Muito utilizadas na indústria alimentícia e de detergentes (1 o lugar).

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4 CARACTERÍSTICAS E MODO DE AÇÃO Exopeptidases: atuam nas extremidades da cadeia polipeptídica Aminopeptidases: agem na extremidade N-terminal liberam aminoácidos livres, dipeptídeos e tripeptídeos. Carboxipeptidases: agem na extremidade C-terminal liberam aminoácidos livres ou dipeptídeos.

5 Aminopeptidases - Proteases que agem na extremidade N-terminal; - Liberam aa livres, dipeptídios e tripeptídios; - Geralmente são metaloproteases

6 Carboxipeptidases - Proteases que agem na extremidade C-terminal; - Liberam aa livres, dipeptídios; - São as serinaproteases, metaloproteases ou cisteínaproteases; - Classificadas pela natureza química de seu sítio ativo.

7 CARACTERÍSTICAS E MODO DE AÇÃO Endopeptidases: atuam no interior da cadeia polipeptídica Serina-proteases (E.C ): possuem aminoácido serina em seu sítio ativo. Atuam em ph de 7 a 11. Serina proteases alcalinas: tripsina, quimotripsina e subtilisina. Cisteína-proteases (E.C ): possuem aminoácido cisteína conjugado com histidina em seu sítio ativo. São mais ativas em ph neutro. Ex: papaína, bromelina, ficina.

8 CARACTERÍSTICAS E MODO DE AÇÃO Endopeptidases: Proteases aspárticas ou ácidas (E.C ): possuem aminoácido ácido aspártico em seu sítio ativo. Atuam em ph ácido. Ex: pepsina e renina e proteases microbianas (Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Neuspora, Endothia e Rhizomucor). Metalo-proteases (E.C ): São enzimas que dependem de metais divalentes para sua atividade. Podem ser neutras ou alcalinas. Ex: neutras colagenases (Clostridium hystoliticum); elastases (Pseudomonas aeruginosa) e termolisina (protease de alta resistência térmica Geobacillus stearothermophilus) Ex: alcalinas proteases de Serratia e Myxobacter.

9 Exemplo de Proteases aspárticas ou ácidas (E.C ): possuem aminoácido ácido aspártico em seu sítio ativo. Atuam em ph ácido. Ex: pepsina e renina e proteases microbianas (Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Neuspora, Endothia e Rhizomucor).

10 PROTEASES VEGETAIS Papaína: Cisteína-protease Extraída do látex dos frutos do mamoeiro (Carica papaya) Comercializada na forma de extrato bruto Atividade em ph 5,0 a 9,0 Temperatura: 60 a 70 o C

11 PROTEASES VEGETAIS Bromelina: Cisteína-protease extraída do pedúnculo e do fruto do abacaxizeiro (Ananas cosmosus) Atividade ótima: ph de 6,0 a 8,0 Inativa em temperaturas superiores a 70 o C Apresenta baixa especificidade para o substrato: hidrolisa ligações que envolvem diversos aminoácidos

12 PROTEASES VEGETAIS Ficina Cisteína-protease menos disponível comercialmente Extraída do látex de diversas espécies do gênero Ficus ph: 6,0 a 8,0 Temperatura: 60 o C Apresenta baixa especificidade para o substrato: hidrolisa ligações que envolvem diversos aminoácidos

13 PROTEASES ANIMAIS Renina ou quimosina: Apresenta grande valor para indústria de alimentos Protease aspártica extraída do 4 o estômago do bezerro (abomaso) Extraída do estômago seco ou fresco com ajuda de soluções salinas Sintetizada na forma de pró-enzima (zimogênio inativo) Altamente específica hidrólise da ligação peptídica entre uma fenilalanina (aa aromático) e uma metionina

14 PROTEASES ANIMAIS Pepsina: Protease aspártica produzida pela mucosa do estômago na forma inativa zimogênio Atividade ótima: ph 1,0 a 4,0 Inativa em ph>6,0 Apresenta baixa especificidade, embora prefira ligações entre aa hidrofóbicos.

15 PROTEASES ANIMAIS Tripsina: É específica para ligações peptídicas contendo resíduos com cadeia lateral com carga elétrica positiva, em condições fisiológicas, tais como a arginina (Arg) e lisina (Lys), na posição R1; Liberada pelo pâncreas na forma de zimogênio Atividade ótima ph de 7,0 a 9,0.

16 PROTEASES ANIMAIS Quimotripsina: Serina-protease semelhante à tripsina Sintetizada como zimogênio no pâncreas Hidrolisa preferencialmente ligações que envolvam aminoácidos aromáticos ph ótimo: 7,0 a 9,0

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18 PROTEASES MICROBIANAS Origem bacteriana: Bacillus e Geobacillus Baixa especificidade mais utilizadas na indústria de detergentes ph 8,0 a 11,0 Tpt: 50 a 60 o C Origem fúngica: Aspergillus oryzae (produz proteases ácidas, alcalinas e neutras) ph: 4,0 a 11,0 Tpt: 40 o C Inativas em tpt >50 o C

19 PROTEASES TRANSGÊNICAS Ex: quimosina (renina)

20 Aplicação Industrial das proteases:

21 Aplicação Industrial das proteases: Panificação Glúten: complexo proteico formado quando a água é combinada com a farinha. Formado por dois constituintes básicos: glutenina: tenacidade gliadina: extensibilidade (prot. Fibrilar) elasticidade (prot. Globular) viscosidade Propriedades de qualidade de panificação: dependem principalmente das propriedades viscoelásticas do glúten --> composição das gluteninas e das gliadinas.

22 Proteínas da farinha GLÚTEN GLIADINA GLUTENINA

23 Com glúten Sem glúten

24 Enzimas: proteases Proteases: 1. Causam a cisão das ligações peptídicas na estrutura do glúten 2. Inicia-se na mistura e continua na fermentação até o cozimento 3. Benefícios: redução de tempo de mistura, aumenta a extensibilidade da massa, e aumento da vida útil nos produtos de panificação 4. Melhoria de aroma e produtos mais macios 5. Proteases de Aspergillus oryzae e A. niger seguras para consumo e baixa especificidade 6. Liberação de grupos NH 2 - e COOH reação de Maillard

25 Aplicação Industrial das proteases: Coagulação do leite Existem quatro tipos de moléculas de caseína, alfa-s1, alfa-s2, beta e kappa. As caseínas alfa e beta são proteínas hidrofóbicas que são rapidamente precipitadas por cálcio. A caseína tipo kappa não precipita na presença de cálcio.

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30 Aplicação Industrial das proteases: Clarificação da cerveja Fermentação Maturação Baixa temperatura: 0 o C Depende do tipo de cerveja Finalidade: destruição do diacetil (amargo) Diacetil se converte em acetoína (sem sabor) pela adição de enzimas Turvação: interação entre compostos fenólicos e polipeptídeos que se insolubilizam a baixas temperaturas

31 Aplicação Industrial das proteases: Clarificação da cerveja Utilização de proteases: Hidrolisam os peptídeos e impedem que eles se insolubilizem evitando turvação Enzimas utilizadas: papaínas inespecíficas e termoestáveis (permanecem ativas após pasteurização) A presença de proteínas é vital para formação de espuma na cerveja aparentemente a adição de papaína não afeta a formação de espuma (moléculas envolvidas são complexos de polipeptídeos, polifenóis, carboidratos e fosfatos não são substratos para a enzima).

32 Aplicação Industrial das proteases: Amaciamento da carne Maciez atributo da carne cozida de ter fácil mastigabilidade sem perder sua textura característica Maturação prolongada catepsinas e calpaínas Aplicação de proteases: hidrolisam proteínas (miofibrilares e colágeno) da carne, tornando-a mais macia Papaína: mais aplicada alta afinidade pela actina e boa atividade pelo colágeno desnaturado pelo calor A papaína possui temperatura de atividade o C garante o amaciamento durante o cozimento.

33 Aplicação Industrial das proteases: Amaciamento da carne Dosagem da papaína: Carnes assadas: passam maior tempo na temperatura de ação da enzima doses menores Carnes fritas: temperaturas muito altas em menores intervalos de tempo doses maiores Carnes destinadas a restaurantes e serviços de alimentação longo tempo de aquecimento mistura bromelina + papaína (bromelina menos termorresistente é inativada após certo período de aquecimento evita hidrólise excessiva)

34 Aplicação Industrial das proteases: Amaciamento da carne Métodos de aplicação da enzima: Método clássico: aplicação superficial da enzima em veículo de sal prático e baixo custo, mas pode apresentar problemas na difusão Imersão: cortes submersos na solução da enzima. Problemas: difusão, contaminação cruzada, diluição da enzima pelos sucos da carne Injeção: uso de seringas e pistolas para aplicação no interior da peça.

35 Aplicação Industrial das proteases: Amaciamento da carne Métodos de aplicação da enzima: Injeção no animal vivo: Pré-tenderização Injeção da enzima na jugular do animal, 10 a 30 min antes do abate Distribuição uniforme da enzima em todos os tecidos através da corrente sanguínea Uso de enzima purificada A enzima não possui atividade na temperatura corporal do animal, só é ativa quando o corte da carne é aquecido

36 Aplicação Industrial das proteases: Amaciamento da carne Injeção no animal vivo: Para evitar hidrólise dos tecidos no animal vivo: enzima inativada antes da injeção com peróxido de hidrogênio (oxidação do sítio ativo da enzima) Nos tecidos após o abate, a concentração de O 2 cai muito, favorecendo a redução do sítio ativo da enzima Atividade significativa só ocorre quando a enzima é aquecida em temperaturas superiores a 60 o C