QUANTA Lite Jo-1 ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada
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- Marco Antônio Azevedo Sanches
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1 QUANTA Lite Jo-1 ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica QUANTA Lite Jo-1 é um ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção semi-quantitativa de anticorpos Jo-1 no soro humano. A presença de anticorpos Jo-1 pode ser utilizada em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes de laboratório para ajudar no diagnóstico de polimiosite e outras doenças relacionadas com o tecido conjuntivo. Resumo e Explicação do teste Os anticorpos antinucleares (ANA) podem ser encontrados numa grande variedade de doenças do tecido conjuntivo e representam um ensaio sensível de rastreio. 1 Embora o teste ANA seja um excelente teste de rastreio para o SLE (um resultado negativo elimina virtualmente a possibilidade do SLE activo) 2, não é de modo algum um teste específico. São observados auto-anticorpos anti antigénio Jo-1, também designado histidil-trna sintetase, num subgrupo de indivíduos com doença do tecido conjuntivo com polimiosite pura, dermatomiosite ou miosite puras associadas a outra doença reumática. 3 São observados anticorpos anti Jo-1 em 18-36% do total de doentes que preenchem os critérios de miosite. 3-6 Os anticorpos são mais comuns na polimiosite do que na dermatomiosite e raramente observados noutras doenças. 5-7 Os anticorpos anti Jo-1 estão fortemente associados à doença intersticial pulmonar, 7,8 apresentando quase todos os doentes Jo-1 positivos envolvimento pulmonar. Tem sido evidenciada uma relação entre o titulo de anticorpos Jo-1 e a actividade da doença. 9 Foi utilizada uma variedade de métodos para detectar os anticorpos anti Jo-1, incluindo a dupla difusão de Ouchterlony e a aglutinação passiva. Também foram desenvolvidos testes ELISA para detectar anticorpos anti-jo-1, uteis clinicamente. A técnica ELISA aplicada neste ensaio é objectiva, semi-quantitativa e pode ser convenientemente empregue para testar um grande número de doentes. Princípio do método O antigénio Jo-1 purificado é ligado aos poços de uma placa de micropoços de poliestireno sob condições que vão preservar o antigénio no seu estado nativo. Os controlos pré-diluídos e o soro diluído dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos Jo-1 presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG anti-humano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrofotometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controlo. Reagentes 1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno revestidos com antigénios purificados de Jo-1 (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos anti Jo-1, pré-diluído, 1,2 ml 3. Positivo baixo Jo-1 ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti Jo-1, pré-diluído, 1,2 ml 4. Positivo alto Jo-1 ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti Jo-1, pré-diluído, 1,2 ml 5. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor de rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 6. Solução de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 7. Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humana, 1 frasco de cor azul com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 8. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 9. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo baixo Jo-1 ELISA, o Positivo alto Jo-1 ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 1
2 4. O conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. De modo a evitar lesões, evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele ou olhos. 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a aspiração insuficiente dos líquidos dos poços ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços das tiras ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do conjugado HRP para evitar estas ocorrências. 9. A contaminação química do conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação do conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras dos micropoços que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8º C. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C. Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A2 da C L S I NCCLS) ( recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. Procedimento Material fornecido 1 Placa de micropoços Jo-1 ELISA (12-1 x 8 poços), com suporte 1 1,2 ml Controlo Negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo baixo Jo-1 ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo alto Jo-1 ELISA, pré-diluído 1 50 ml Diluente da amostra HRP 1 25 ml Solução de lavagem HRP, 40x concentrado 1 10 ml Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humano 1 10 ml Cromogénio TMB 1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M 2
3 Material adicional necessário mas não fornecido Micropipetas de 5, 100, e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para concentrado de lavagem HRP diluído Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leitura dupla de comprimento de onda) Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de solução de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantém-se estável durante uma semana a 2-8º C. 3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de diluente de amostras HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR o Positivo baixo Jo-1 ELISA, o Positivo alto Jo-1 ELISA e o Controlo negativo ELISA. 4. A determinação da presença ou ausência de Jo-1 utilizando unidades arbitrárias requer o uso de dois poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra de doente. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. Técnica 1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR -SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água. 2. Adicione 100 µl do Positivo baixo Jo-1 ELISA, do Positivo alto Jo-1 ELISA, do Controlo Negativo ELISA pré-diluídos e das amostras diluídas aos respectivos poços. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra. 3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione µl de solução de lavagem HRP diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na adição das amostras. 4. Adicione 100 µl do Conjugado HRP IgG a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. P AR A E V ITAR U MA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no passo Lavagem: Repita o passo Adicione 100 µl do Cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente. 7. Adicione 100 µl de solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da solução de paragem HRP, tal como efectuado para o cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços. 8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm. Controlo de qualidade 1. O Positivo baixo Jo-1 ELISA, o Positivo alto Jo-1 ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser processados com cada lote de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. 2. Uma vez que o Positivo baixo Jo-1 ELISA, o Positivo alto Jo-1 ELISA e o Controlo Negativo ELISA são pré-diluídos, não controlam o procedimento associado à diluição de amostras. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros soros de controlo adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20 C. 4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do Positivo alto Jo-1 ELISA pré-diluído deve ser superior à absorvância do Positivo baixo Jo-1 ELISA pré-diluído, que deve ser superior à absorvância do Controlo negativo ELISA pré-diluído. 3
4 b. O Positivo alto Jo-1 ELISA pré-diluídos deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto o Controlo negativo ELISA pré-diluído não pode ter uma absorvância superior a 0,2. c. A absorvância do Positivo baixo Jo-1 ELISA deve ser mais do dobro da absorvância do Controlo Negativo ELISA ou superior a 0,25. d. O Controlo negativo ELISA e o Positivo alto Jo-1 ELISA servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O Positivo alto Jo-1 ELISA não garante precisão no ponto de decisão do ensaio. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A da CLSI (NCCLS) para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas. Cálculo dos resultados Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica média (DO) para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode então ser calculada dividindo a DO média da amostra pela DO média do Positivo baixo Jo-1 ELISA. O resultado é multiplicado pelo número de unidades dos Positivos baixos Jo-1 ELISA que se encontram no rótulo. Densidade óptica da amostra Valor da amostra = x Positivo baixo Jo-1 ELISA (unidades) DO do Positivo baixo Jo-1 ELISA (unidades) A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num respectivo aumento ou diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de anticorpos não duplica a reactividade). Se for requerida uma quantificação mais exacta dos anticorpos do doente, será necessário efectuar diluições em série das amostras do doente, e a última diluição com resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o título de anticorpos do doente. Interpretação dos resultados O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças em populações de doentes. Os valores abaixo indicados são apenas valores sugeridos. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, baseados nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. A amostra pode ser classificada de negativa, fracamente positiva, moderadamente positiva ou fortemente positiva, de acordo com a tabela seguinte. Unidades Negativa <20 Fracamente Positiva Moderadamente positiva Fortemente positiva >80 1. Um resultado positivo indica a presença de anticorpos Jo-1 e sugere a possibilidade de polimiosite ou de outras doenças relacionadas com o tecido conjuntivo. 2. Um resultado negativo indica ausência de anticorpos Jo-1 ou de níveis abaixo do ponto de decisão do ensaio. 3. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório incluam a declaração: Os seguintes resultados foram obtidos com INOVA QUANTA Lite Jo-1 ELISA. Valores Jo-1 obtidos através de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis de IgG descritos não pode ser correlacionada com um título final. Limitações do método 1. A presença de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente podem causar um aumento do nível de ligação não-específica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio. 2. Nem todos os doentes com polimiosite são Jo-1 positivos. 3. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos. 4. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro. Valores esperados A capacidade do teste QUANTA Lite Jo-1 ELISA para detectar anticorpos Jo-1, foi avaliada através da comparação com um teste de dupla difusão, disponivel no mercado, da INOVA Diagnostics, Inc. Os resultados do teste de Ouchterlony foram considerados como positivos se existisse uma linha de precipitação identificável, e negativos, caso não se observasse nenhuma linha ou uma linha de nãoidentidade. Intervalo de valores normais Cento e oito amostras de soro aleatórias foram seleccionadas e testadas com o ensaio Jo-1 ELISA. A média da população testada foi de 2,0 unidades com um desvio padrão de 0,5 unidades. O intervalo dos valores da população variou entre 3,5 e 1,2 unidades. Este ensaio indica que a média normal é superior a 36 desvios padrão abaixo do ponto de decisão. 4
5 Sensibilidade e Especificidade Relativa Para determinar a sensibilidade e especificidade relativa do ensaio, 235 amostras ANA positivas contendo anticorpos de uma grande variedade de antigénios nucleares foram testadas por ambos os métodos, por Ouchterlony e por ELISA. Das 235 amostras testadas, 12 foram positivas e 223 negativas por ambos os métodos. Os resultados do ensaio Jo-1 ELISA encontram-se resumidos na tabela seguinte. INOVA Sensibilidade relativa 100% OT Especificidade relativa 100% Eficiência relativa 100% Precisão e Reprodutibilidade A precisão e a reprodutibilidade do ensaio foram medidas testando seis réplicas de cada tipo de amostra, moderadamente positiva e fracamente positiva, em seis ensaios distintos. A reactividade média da fortemente positiva foi de 47,3 unidades, enquanto que o valor médio da fracamente positiva foi de 24,0. O desvio padrão e o coeficiente de variação para cada amostra encontram-se resumidos na tabela que se segue. Moderadamente positiva Fracamente Positiva DP CV DP CV Total 2,5 5,3% 1,0 4,2% Dentro do teste 2,6 5,6% 0,5 2,0% Entre testes 0,6 1,4% 1,0 4,3% QUANTA Lite e INOVA Diagnostics são marcas registradas Copyright 2011 Todos os Direitos Reservados 5
6 Referências 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ana): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Biwas T, et al.: An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection and quantitation of anti-jo1 antibody in human serum. J Immunol Methods 98: 243, Nishikai M and Reichlin M: Heterogeneity of precipitating antibodies in polymyositis and dermatositis: characterization of the Jo-1 antibody system. Arthritis and Rheumatism 23: 881, Arnett J, et al.: The Jo-1 antibody system in myositis: relationships to clinical features and HLA. J Rheumatol 8: 925, Reichlin M, et al.: Antibodies to a nuclear/nucleolar antigen in patients with polymyositis overlap syndrome. J Clin Immunol 4: 40, Bernstein R, et al.: Anti-Jo-1 antibody: a marker for myositis with interstitial lung disease. Br Med J 289: 151, Hochberg M, et al.: Antibody to Jo-1 in polymyositis/dermatomyositis: association with interstitial pulmonary lung disease. J Rheumatol 11: 663, Yoshida S, et al.: The precipitation antibody to an acidic nuclear protein antigen, the Jo-1 in connective tissue diseases: a marker to a subset of polymyositis with interstitial pulmonary fibrosis. Arthritis and Rheumatism 26: 604, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT November 2011 Revision 15 6
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