QUANTA Lite TM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada

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1 QUANTA Lite TM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica O QUANTA Lite TM CCP3.1 IgG/IgA ELISA é um ensaio imunoenzimático para a detecção de anticorpos IgG e IgA anti-ccp3 (3 péptido citrulinado cíclico) no paciente soro ou citrado ou plasma EDTA. A presença destes anticorpos, quando considerados conjuntamente com outras descobertas laboratoriais e clínicas, é uma ajuda no diagnóstico de artrite reumatóide (AR), incluindo AR diagnosticada até 2 anos após o surgimento de sintomas. Resumo e Explicação do teste A artrite reumatóide (AR) é uma das doenças auto-imunes sistémicas mais comuns, que afecta aproximadamente 0,5% da população mundial. 1 O diagnóstico depende principalmente das manifestações clínicas da doença. Até há pouco tempo, o único teste serológico usado habitualmente era a determinação da presença do factor reumatóide (FR), encontrado em cerca de 50%-90% desses doentes. 1,2 No entanto, o FR também é encontrado em pessoas com infecções, outras doenças autoimunes e alguns indivíduos saudáveis. 1,2 É importante para a gestão da doença o diagnóstico e tratamento de pessoas com AR o mais cedo possível. 3 Sabe-se há muitos anos que os auto-anticorpos antiperinucleares, também denominados auto-anticorpos anti-queratina, se encontram em pessoas com AR. Recentemente foi descoberto que estes anticorpos reconhecem um epítopo que contenha a forma de arginina denominada citrulina. 4,5 Um péptido circular contendo citrulina, denominado CCP (Péptido citrulinado cíclico), foi considerado como melhor para a diferenciação de doentes com AR de outros doentes do que o teste de anticorpo perinuclear ou os testes do factor reumatóide. 6,7 Numa análise da literatura publicada 8, 68% dos doentes com AR são positivos a anti-ccp, enquanto uma média de 5% de indivíduos não AR são positivos. Um ELISA realizado com a sequência CCP 5 descrita anteriormente não foi comercializado amplamente. No entanto, um teste anti-ccp de segunda geração (denominado CCP2 por algumas empresas) está amplamente disponível e mostra um desempenho superior comparado com o péptido original. 9 A INOVA denomina o teste de segunda geração como CCP IgG ELISA. Muito importante, os anti-ccp encontramse em pacientes com AR 8 inicial, prevendo por vezes o futuro desenvolvimento de AR melhor que o FR. 4,7 Os anticorpos de alguns doentes com AR que são negativos com anti-ccp2 são reactivos a outras proteínas citrulinadas, 6,7 sugerindo que são epítopos adicionais que não estão presentes na sequência do antigénio CCP de segunda geração. Em 2005 disponibilizaram-se kits que utilizam antigénio da 3.ª geração (CCP3). Estes kits de péptidos de 3ª geração demonstraram ser aproximadamente 5% mais sensíveis quando comparados com kits que utilizam o antigénio CCP2 e de especificidade comparável. 10 O antigénio utilizado no kit QUANTA Lite TM CCP 3.1 é o peptídeo CCP3 mais recente da 3.ª geração. Este kit utiliza um conjugado que detecta anticorpos IgA para além dos anticorpos IgG habituais. No kit CCP 3 a sensibilidade é melhorada devido a alguns doentes AR terem anticorpos IgA contra o CCP 3, na ausência de IgG. 11 As melhorias adicionais no CCP 3.1 ELISA incluem poços de intervalo com código de cor e a capacidade de utilizar amostras de plasma ou de soro dos doentes. Princípio do método O antigénio utilizado no teste QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA é um péptido sintético cíclico citrulinado que tem uma sensibilidade e especificidade elevada na detecção de anticorpos em doentes com AR. Este antigénio está ligado à superfície de uma placa de micropoços. Os controlos pré-diluídos e as amostras diluídas dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos CCP IgG e/ou presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG/IgA anti-humano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controlo. Reagentes 1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno revestida com antigénios purificados, sintéticos CCP 3.1 (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos anti CCP, pré-diluído, 1,2 ml 3. Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro 4. Positivo Alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA (Calibrador A), 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro 1

2 5. Calibrador B CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro 6. Calibrador C CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro 7. Calibrador D CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e anticorpos de soro 8. Calibrador E CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro 9. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor-de-rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 10. Solução de lavagem Specificity Elevado, 1 frasco 10x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 100 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 11. Conjugado HRP CCP 3.1 IgG/IgA, (de cabra), IgG/IgA anti-humana, 1 frasco d de cor amarela com tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 12. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 13. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, o Positivo alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a aspiração insuficiente dos líquidos dos poços ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecante pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do conjugado HRP para evitar estas ocorrências. 2

3 9. A contaminação química do conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação do conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras dos micropoços revestidas com antigénios que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8º C. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C. Colheita da amostra Este procedimento deve ser realizado com uma amostra de soro ou amostra de plasma citrado ou EDTA, uma vez que estas amostras apresentam resultados idênticos. Não deve ser usado plasma com lítio e heparina porque pode apresentar resultados diferentes dos do soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A3 da NCCLS recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. Procedimento Material fornecido 1 Placa de micropoços CCP 3.1 IgG/IgA ELISA (12-1 x 8 poços), com suporte 1 1,2 ml Controlo negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, pré-diluído (Calibrador A) 1 1,2 ml Calibrador B CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Calibrador C CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Calibrador D CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Calibrador E CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, pré-diluído 1 50 ml Diluente da amostra HRP ml Solução de lavagem Specificity Elevado, 10x concentrado 1 10 ml Conjugado HRP CCP 3.1 IgG/IgA, (de cabra), IgG/IgA anti-humana 1 10 ml Cromogénio TMB 1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M Material adicional necessário mas não fornecido Micropipetas de 5, 100, e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para solução de lavagem Specificity Elevado diluído Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda) Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir a solução de lavagem Specificity Elevado 1:10, adicionando o conteúdo do frasco da solução de lavagem Specificity Elevado a 900 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 10,0 ml de concentrado a 90 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantém-se estável durante uma semana a 2-8º C. 3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de diluente de amostras HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR o Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, o Positivo alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA e o Controlo negativo ELISA. 4. A determinação da presença ou ausência de anticorpos anti-ccp 3.1 IgG/IgA utilizando unidades arbitrárias requer o uso de dois poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. 3

4 5. Se desejar, os resultados podem ser quantificados utilizando uma curva padrão de 5 pontos. Utilizar os calibradores pré diluidos CCP 3.1 IgG/IgA A-E directamente do frasco. Os 5 pontos da curva apresentam os seguintes valores: Ponto Unidades A Calibrador A pré diluido CCP 3.1 IgG/IgA 250,0 B Calibrador B pré diluido CCP 3.1 IgG/IgA 125,0 C Calibrador C pré diluido CCP 3.1 IgG/IgA 62,5 D Calibrador D pré diluido CCP 3.1 IgG/IgA 31,25 E Calibrador E pré diluido CCP 3.1 IgG/IgA 15,62 Técnica 1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecantes, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água. 2. Adicione 100 µl de Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, de Positivo alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, dos Calibradores B a E CCP 3.1 IgG/IgA ELISA pré-diluídos, se necessário, de Controlo negativo ELISA pré-diluídos e das amostras diluídas aos respectivos poços. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra. 3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione µl de solução de lavagem Specificity Elevado diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na adição das amostras. 4. Adicione 100 μl do Conjugado HRP CCP 3.1 IgG/IgA a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no ponto Lavagem: Repita o passo Adicione 100 µl do cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente. 7. Adicione 100 µl de solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da Solução de paragem HRP, tal como efectuado para o Cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços. 8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm. Controlo de qualidade 1. O Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, o Positivo alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA e o Controlo negativo ELISA devem ser processados com todos os lotes de amostras, para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. 2. Uma vez que o Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, o Positivo alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA e o Controlo negativo ELISA se encontram pré-diluídos, estes não controlam o procedimento associado à diluição das amostras. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20ºC. 4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do Positivo alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA pré-diluído deve ser superior à absorvância do Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA pré-diluído, que deve ser superior à absorvância do Controlo negativo ELISA pré-diluído. b. O Positivo alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA pré-diluído deve ter uma densidade óptica superior a 1,0, enquanto que a absorvância do Controlo negativo ELISA pré-diluído não pode ser superior a 0,2. c. A absorvância do Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA deve ser mais do dobro da absorvância do Controlo negativo ELISA ou superior a 0,25. d. O Controlo negativo ELISA e o Positivo alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O Positivo alto CCP 3.1 IgG/IgA ELISA não consegue assegurar a precisão no ponto de decisão do ensaio. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A3 da CLSI (NCCLS) para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas. 4

5 Cálculo dos resultados semi-quantitativos Método razão Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica média (DO) para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode ser calculada dividindo a densidade óptica média da amostra pela densidade óptica média (DO) do Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA. O resultado é multiplicado pelo número de unidades do Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA que se encontram no rótulo. Densidade óptica da amostra Valor da amostra = x Positivo baixo (unidades) DO do Positivo baixo CCP 3.1 IgG/IgA ELISA CCP 3.1 IgG/IgA ELISA (unidades) A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num correspondente aumento ou diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de anticorpos não duplica a reactividade). Método de cálculo opcional: Resultados semi-quantitativos usando a curva padrão Cálculo dos resultados com a curva padrão opcional 1. Determine o valor médio das leituras efectuadas em duplicado. 2. Faça a absorvância média (DO) das amostras na curva padrão contra os seus valores em unidades. Use uma linha polinomial cúbica, linear/linear, (Cubic Spline) (polinómio de terceira ordem) ou uma linha ponto a ponto para desenhar a curva. 3. Determine as concentrações CCP 3.1 IgG/IgA desconhecidas das amostras em unidades no eixo do Y por leitura da absorvância correspondente no eixo do X. Calcule as unidades desconhecidas. 4. Nota: Os valores calculados com o método razão são diferentes dos que são calculados com curva padrão. Os valores elevados vão diferir mais dos valores baixos. O Positivo alto CCP 3.1 IgG/IgA não dá um valor de 250 unidades com o método razão. Interpretação dos resultados O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças nas populações de doentes. Os valores abaixo indicados são apenas valores sugeridos. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, com base nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. A amostra pode ser classificada de negativa, fracamente positiva, moderadamente positiva ou fortemente positiva, de acordo com a tabela seguinte. Unidades Negativo <20 Fracamente Positivo Moderadamente positivo Fortemente positivo Um resultado positivo indica a presença de anticorpos CCP 3.1 IgG/IgA e sugere a possibilidade de AR. 2. Um resultado negativo indica ausência do anticorpo CCP 3.1 IgG/IgA ou níveis abaixo do limite do ponto de decisão do ensaio. 3. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório devem incluir a declaração: Os resultados apresentados foram obtidos com o dispositivo INOVA QUANTA Lite TM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA. Os valores CCP 3.1 IgG/IgA obtidos através de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis de IgG o IgA descritos não pode ser correlacionada com um título final. Limitações do método 1. A presença de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente pode causar um aumento do nível de ligação não-específica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio. 2. Nem todos os doentes com AR são positivos para os anticorpos CCP. 3. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos. 4. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro ou amostra de plasma citrado ou EDTA. 5. O valor do diagnóstico do anti-ccp 3.1 IgG/IgA em doentes juvenis com artrite reumatóide ainda não foi determinado. 6. Substâncias Interferentes: Níveis elevados de hemoglobina, bilirrubina, colesterol ou triglicéridos não causam resultados falsos positivos ou falsos negativos. 5

6 Valores esperados das amostras clínicas A capacidade de o QUANTA Lite TM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA detectar anticorpos IgG CCP 3.1IgG/IgA foi avaliada através da comparação de 942 amostras com um ELISA que mede IgG anti-ccp2. Foram incluídos 495 doentes com um diagnóstico clínico de AR dos estudos internos (186) e externos (309). Também foram testados soros de 275 dadores de sangue aleatórios. Dos 272 em que estava disponível a informação de idade e sexo, 97 eram mulheres e a idade média era de 42,4 anos. Os controlos de doenças incluíram 74 pessoas com outras doenças reumáticas (ORD) como, por exemplo, lúpus eritematoso sistémico (34), síndroma de Sjögren (16) e esclerodermia (24), bem como 98 amostras adicionais com anticorpos de doenças infecciosas (ID) como, por exemplo, hepatite C (58), vírus de herpes simplex (15), citomegalovirus (14), toxoplasmose (6) e rubéola (5) num grande estudo interno. Sensibilidade e Especificidade Clínica A tabela seguinte descreve os resultados de todos os nossos estudos clínicos. Amostras N=942 CCP 3 ELISA CCP IgG ELISA AR (Totais N=495) AR - com até 2 anos (N=86) Controlos totais (N=447) Dadores de sangue (N=275) Outras doenças reumáticas (N=74) Doenças infecciosas (N=98) Sensibilidade Clínica [(95% Intervalo de confiança (CI)] = CCP 3.1 = 70,3% (66-74%) CCP = 64,6% (60-69%) Em AR com até 2 anos = CCP 3.1 = 64,0% (52-74%) CCP = 54,7% (43-65%) Especificidade Clínica (95% CI) = CCP 3.1 = 97,8%, (96-99%) CCP = 98,2% (97-99%) Comparação do método N=942 CCP3.1 IgG/IgA ELISA CCP IgG ELISA Totais % Concordância (95% CI) Positivo Negativo Positivo * 358 Pos. % Concordância = 97,6% (95,3-98,9%) Negativo 8** Neg. % Concordância =93,8% (91,6-95,6%) Totais Tot. % Concordância =95,1% *33 destes amostras diagnosticados com AR. **5 destes amostras diagnosticados com AR. Reactividade cruzada Para determinar a reactividade cruzada do antigénio CCP 3.1 com outros auto-anticorpos, o QUANTA Lite CCP 3.1 ELISA foi avaliado com 16 amostras, todas com níveis altos de outros diferentes autoanticorpos. Neste grupo foram incluídas duas amostras de cada que reagiram com SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribo-P e dsdna. Todas as amostras deram resultados negativos ao anti-ccp 3.1. O estudo anterior não apresenta uma reactividade cruzada significativa do antigénio CCP 3.1 com uma variedade de outros auto-anticorpos. Precisão e Reprodutibilidade A variação do ensaio intercalar foi medida testando em duplicado as amostras com resultados negativos, positivos baixos e fortemente positivos em seis ensaios separados em 5 dias diferentes. A variação dentro do teste foi medida testando 9 amostras 9 ou 10 vezes cada na mesma placa ELISA. Os resultados representativos encontram-se abaixo indicados. Variação inter-ensaio Negativa 1 Fracamente 1 Fracamente 2 Fortemente 1 1 pt.* 5 pt.** 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. Unidades médias 6 U 4 U 22 U 23 U 28 U 30 U 69 U 85 U Desvio padrão 0,4 0,5 0,7 0,6 0,8 1,2 1,7 1,2 Coeficiente de variação % 8% 11% 3% 3% 3% 4% 2% 1% Variação intra-ensaio Negativa. 1 Fracamente 1 Fracamente 2 Fortemente 1 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. Unidades médias 4 U 2 U 22 U 24 U 26 U 30 U 68 U 81 U Desvio padrão 0,2 0,2 0,9 1,1 0,9 1,0 1,9 3,2 Coeficiente de variação % 4% 13% 4% 5% 3% 3% 3% 4% *Resultados do teste do método de rácio **Resultados do teste da curva padrão 6

7 Referências 1. Wener MH: Rheumatoid Factors. Manual of Clinical Laboratory Immunology, NR Rose et al., eds, American Society for Microbiology Press, (2002). 2. Borretzen M et al.: Rheumatoid Factors. Autoantibodies, Peter JB and Shoenfeld Y, eds, Elsevier Science B.V., (1996). 3. Kim JK and Weisman MH: When does rheumatoid arthritis begin and why do we need to know? Arthritis Rheum 43: (2000). 4. Vossenaar ER and Van Venrooj WJ: Anti-CCP antibodies, a highly specific marker for (early) rheumatoid arthritis. Clin Applied Immunol Rev 4: (2004). 5. Schellekens GA et al.: Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest. 101: (1998). 6. Vittecoq O et al.: Autoantibodies recognizing citrullinated rat filaggrin in an ELISA using citrullinated and non-citrullinated recombinant proteins as antigens are highly diagnostic for rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 135: (2004). 7. Saraux A et al.: Value of antibodies to citrulline-containing peptides for diagnosing early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 30: (2003). 8. Avovac J et al: Diagnostic and predictive value of anti-cycllic citrullinated protien antibodies in rheumatiod arthritis: a systematic literature review. Ann Rheum Dis 65: (2006). 9. van Gaalen FA et al.: A comparison of the diagnostic accuracy and prognostic value of the firstand second anti-cyclic citrullinated peptide autoantibody (CCP1 and CCP2) tests for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 64: (2005) 10. Mittermayer S et al.: A comparison of the frequency of autoantibodies to cyclic citrullinated peptides using a third generation CCP assay (CCP3) in systemic sclerosis, primary biliary cirrhosis and rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol June 15, e-pub ahead of print (2007). 11. Vieira LEA et al: Rheumatoid arthritis diagnosis: a comparative study of second and third generation anti-cyclic citrullinated peptide (CCP) ELISAs. Arthritis Rheum 56: S724 (2007). 12. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service PRT October 2009 Revision 2 7