QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada

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1 QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA é um ensaio imunossorbente com enzimas ligadas (ELISA) para a detecção semi-quantitativa de anticorpos mitocondriais, anticorpos gp210, e anticorpos sp100 das classes IgG e/ou IgA no soro humano. A presença de anticorpos mitocondriais gp210 e sp100 pode ser utilizada conjuntamente com os achados clínicos e outros testes laboratoriais para ajudar no diagnóstico de cirrose biliar primária. Resumo e Explicação do teste A cirrose biliar primária (PBC-Primary biliary cirrhosis) é uma doença crónica do fígado caracterizada pela destruição de pequenos ductos de bile intra-hepáticos. A destruição progressiva dos ductos conduz a prejuízo funcional crescente do fígado, e com o tempo, pode provocar a falha do fígado e tornar necessário o transplante. 1,2 A etiologia da CBP é desconhecida, se bem que um componente genético assim como outros factores possam ser importantes para o desenvolvimento da doença. 3,4 A CBP ocorre tipicamente entre as idades de 30 a 65, e afecta mulheres com mais frequência que homens (a proporção feminina:masculina estimada é de 9:1). 3,4 A prevalência de CBP, nos parentes em primeiro grau dos doentes com CBP, é de 1,3 a 6,4%. 4,5 A CBP é encontrada em todas as raças e tem uma larga distribuição por todo o mundo. Foram informadas grandes variações em termos de prevalência geográfica da CBP, com estimativas de 2 por no Japão e Austrália a 40 por nos Estados Unidos. 3,6 A marca do contraste serológico da CBP é a presença de anticorpos anti-mitocondriais (AMA) e pode ser detectada em mais de 90-95% dos doentes com CBP. Os anticorpos anti-mitocondriais foram detectados em indivíduos assintomáticos com níveis químicos hepáticos e histologia normal. Alguns destes indivíduos irão desenvolver CBP com o passar do tempo. 7-9 Os principais auto-antigénios alvo dos AMA são as subunidades E2 do complexo piruvato desidrogenase (PDC-E2), da cadeia ramificada do complexo 2-oxo-ácido desidrogenase (BCOADC-E2) e do complexo 2- oxo-glutarato desidrogenase (OGDC-E2). 10 Gershwin e Leung desenvolveram e patentearam um antigénio recombinante (MIT3) que contém epítopes imunodominantes destas três subunidades. 11 Os ensaios baseados no MIT3 têm uma melhor desempenho, do que os ensaios ELISA que utilizam o convencional PDC-E2. 11,12 Em adição aos AMA, cerca de 50-72% do soro de doentes com CBP contêm anticorpos antinucleares (ANA). Dois padrões ANA especificamente associados à CBP são: arco nuclear pontuado/coloração membranosa característica da proteína da membrana do poro nuclear, gp210, e um ponto nuclear múltiplo (MND) característico da proteína associada ao corpo nuclear, sp100. Os anticorpos anti-gp210 e anti-sp100 têm sido encontrados em, aproximadamente, 25% dos doentes com CBP e são altamente específicos para a CBP. Adicionalmente, estes anticorpos são encontrados em 10-50% dos doentes com CBP e AMA negativo, e podem ser os únicos anticorpos específicos para CBP detectados. Embora a maioria dos ensaios convencionais apenas detectam anticorpos AMA IgG, os anticorpos AMA IgA também estão presentes no soro, bílis, saliva e na urina dos indivíduos com CBP. 13,14 Foi sugerido que o anti-cbp IgA secretório pode desempenhar um papel na patogénese da CBP. 14 Os doentes com suspeita de doença do fígado auto-imune, mas que não satisfazem todos os critérios clássicos, podem ser um desafio, clinicamente falando. Os indivíduos com CBP e AMA negativo caem dentro deste grupo. Novos ensaios para detecção de anticorpos para gp210, sp100 e AMA, utilizando a sensibilidade aumentada do antigénio MIT3, reduziram o número de doentes com CBP sem evidência serológica desta. O QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA detecta anticorpos para os marcadores específicos da CBP: MIT3, sp100 e gp210. O conjugado de dupla especificidade (IgG/IgA) oferece uma aumentada sensibilidade no que se refere à detecção de amostras que possam ser fracas ou negativas no teste com um conjugado monoespecífico (apenas IgG). O teste combinado para os anticorpos IgG e IgA, para MIT3, gp210 e sp100, providencia uma ferramenta para o teste de indivíduos com suspeita de CBP. Princípio do método Uma mistura contendo antigénio recombinante purificado e com afinidade, (MIT3), a qual inclui porções imunodominantes de PDC-E2, BCOADC-E2, OGDC-E2, um fragmento purificado da proteína sp100 e um fragmento purificado da proteína gp210, é ligada aos poços de uma placa de um micropoço de poliestireno sob condições que preservarão os antigénios no seu estado nativo. Os controlos pré-diluídos e o soro diluído do doente são adicionados a poços separados, permitindo a qualquer anticorpo para mitocôndria, sp100 ou gp210 que estejam presentes que se liguem ao antigénio imobilizado.os controlos pré-diluídos e o soro diluído dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos PBC Screen IgG/IgA presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG/IgA anti-humano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controlo. 1

2 Reagentes 1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno revestidos com antigénios purificados de PBC Screen antígeno (mistura do purificado MITC, sp100 and gp210 antígenos) (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos anti PBC Screen, pré-diluído, (pronto a utilizar) 1,2 ml 3. Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti PBC Screen, pré-diluído, (pronto a utilizar) 1,2 ml 4. Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti PBC Screen, pré-diluído, (pronto a utilizar) 1,2 ml 5. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor-de-rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 6. Solução de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 7. Conjugado HRP PBC Screen IgG/IgA, (de cabra), IgG/IgA anti-humana, 1 frasco incolor com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 8. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 9. Solução de Paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA, o Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA e o Controlo Negativo devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O Conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O Cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 6. A Solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a aspiração insuficiente dos líquidos dos poços ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de Conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do Conjugado HRP para evitar estas ocorrências. 9. A contaminação química do Conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação do Conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos. 2

3 Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras dos micropoços revestidas com antigénios que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8º C. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C. Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A3 da CLSI (NCCLS) recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. 16 Procedimento Material fornecido 1 Placa de micropoços PBC Screen IgG/IgA ELISA (12-1 x 8 poços), com suporte 1 1,2 ml Controlo Negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA, pré-diluído 1 50 ml Diluente da amostra HRP 1 25 ml Solução de lavagem HRP, 40x concentrado 1 10 ml Conjugado HRP PBC Screen IgG/IgA, (de cabra), IgG/IgA anti-humana 1 10 ml Cromogénio TMB 1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M Material adicional necessário mas não fornecido Micropipetas de 5, 100, e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para Solução de lavagem HRP diluída Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda) Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de Solução de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantémse estável durante uma semana a 2-8º C. 3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de Diluente da amostra HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR o Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA, o Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA e o Controlo Negativo ELISA. 4. A determinação da presença ou ausência de anticorpos PBC Screen IgG/IgA antígenos utilizando unidades arbitrárias requer o uso de dois poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. Técnica 1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água. 2. Adicione 100 µl de Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA, de Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA, de Controlo Negativo ELISA pré-diluídos e das amostras diluídas dos doentes aos poços. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra. 3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione µl de Solução de lavagem HRP diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada 3

4 4. Adicione 100 μl do Conjugado HRP PBC Screen IgG/IgA a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no passo Lavagem: Repita o passo Adicione 100 µl do Cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente. 7. Adicione 100 µl de Solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da Solução de paragem HRP, tal como efectuado para o Cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços. 8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm. Controlo de qualidade 1. O Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA, o Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. 2. Uma vez que o Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA, o Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA e o Controlo Negativo ELISA se encontram pré-diluídos, estes não controlam o procedimento associado à diluição das amostras. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20 C. 4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA pré-diluído deve ser superior à absorvância do Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA pré-diluído, que deve ser superior à absorvância do Controlo Negativo ELISA pré-diluído. b. O Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA pré-diluído deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto que a absorvância do Controlo Negativo ELISA pré-diluído não pode ser superior a 0,2. c. A absorvância do Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA deve ser mais do dobro da absorvância do Controlo Negativo ELISA ou superior a 0,25. d. O Controlo Negativo ELISA e o Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O Positivo Alto PBC Screen IgG/IgA ELISA não consegue assegurar a precisão no ponto de decisão do ensaio. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A2 da CLSI (NCCLS) para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas. 17 Cálculo dos resultados Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica média (DO) para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode ser calculada dividindo a DO média da amostra pela DO média do Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA. O resultado é multiplicado pelo número de unidades do Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA que se encontram no rótulo. Densidade óptica da amostra Valor da amostra = x Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA (unidades) DO do Positivo Baixo PBC Screen IgG/IgA ELISA (unidades) A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num correspondente aumento ou diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de anticorpos não duplica a reactividade). Se for necessária uma quantificação mais exacta dos anticorpos do doente, será necessário efectuar diluições em série das amostras do doente, e a última diluição com resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o título de anticorpos do doente. Interpretação dos resultados O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças nas populações de doentes. Os valores abaixo indicados são apenas valores sugeridos. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, com base nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. A amostra pode ser classificada como negativa, ambígua ou positiva conforme indicado na tabela em baixo. Unidades Negativa 20 Ambígua 20,1 24,9 Positiva > 25 4

5 1. Um resultado positivo indica a presença de anticorpos PBC Screen e sugere a possibilidade de anemia perniciosa ou doenças relacionadas. 2. Um resultado negativo indica ausência de anticorpos para Mitocôndria, gp210 e sp100 ou níveis abaixo do limite negativo do ensaio (limite mínimo). 3. Os espécimes com resultados positivos podem ser testados para a presença de anticorpos individuais MIT3, gp21o e sp100 com ensaios ELISA específicos para MIT3, gp210 e sp Um espécime com níveis de anticorpos não conclusivos não pode ser avaliado relativamente ao estado dos anticorpos. É recomendado uma repetição do teste em nova amostra ou passado um tempo. 5. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório devem incluir a declaração: Os seguintes resultados foram obtidos com o dispositivo INOVA QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA. Valores PBC Screen IgG/IgA obtidos através de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis de IgG/IgA descritos não pode ser correlacionada com um título final. Limitações do método 1. A presença de imunocomplexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente pode causar um aumento do nível de ligação não-específica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio. 2. Nem todos os doentes com cirrose biliar primária são positivos no que respeita aos anticorpos para os antigénios utilizados no despiste de CBP. 3. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos. 4. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro. Valores esperados Intervalo de valores normais Um painel de 520 indivíduos saudáveis, assintomáticos, residentes nos Estados Unidos, foi testado com QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA. Dados sobre a idade e o sexo estiveram disponíveis para 307 espécimes. A idade esteve entre os 18 e os 78 anos e incluiu 150 indivíduos do sexo masculino e 157 do sexo feminino. O valor médio para esta população foi de 6,6 unidades e o valor mediano foi de 4,6 unidades. A especificidade do ensaio foi de 98,1 % (510/520) para os sujeitos normais. Das 10 amostras positivas 7 mostraram reactividade no M2 EP(MIT3) IgG ELISA e 1 espécime foi reactivo quando testado para os anticorpos M2 EP(MIT3) IgA. Características Específicas Estudos Clínicos Um total de 440 doentes com CBP e 769 sem CBP, o qual incluiu 520 normais e saudáveis, foram analisados pelo QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA para avaliar a especificidade e a sensibilidade do teste. Os espécimes com CBP e AMA negativo ou os doentes com suspeita de doença, não confirmada, e os doentes AIH foram excluídos. O grupo CBP (440) incluiu espécimes de 426 indivíduos com CBP definitiva e 14 com sobreposição CBP/AIH. O grupo não-cbp incluiu espécimes de 520 controlos saudáveis e espécimes de indivíduos com hepatite viral (HBV ou HCV) (149), PSC (48) e doença do fígado sem ser CBP (23) e doença infecciosa ou outra auto-imune (29). O valor da média e o valor mediano do grupo não- CBP foi de 8,1 e de 5,3 unidades, respectivamente. Os resultados apresentam-se resumidos na Tabela 1. Tabela 1: Especificidade e Sesibilidada de QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA N=1209 n positivo ambígua negativo PBC Groupo CBP Non-Groupo Sesibilidada: 95,9% (422/440); 95% Confiança Intervalo (CI): 93,6% to 97,6% Especificidade: 96,1% (739/769); 95% CI: 94,5% to 97,4% Concordância global (resultados ambíguos considerados negativos): 96,0% (1161/1209) Comparação com Dispositivos Afirmados O QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA foi comparado com o QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA individual, QUANTA Lite TM gp210 ELISA, e com o QUANTA Lite TM sp100 ELISA. Um total de 1209 espécimes (440 CBP clínicas, 249 não-cbp e 520 indivíduos saudáveis assintomáticos) foi testado no PBC Screen e no QUANTA Lite MIT3 individual, ELISA sp100 e gp210. Indivíduos QUANTA Lite TM Teste N=1209 Positivo Ambígua* Negativo Positivo QUANTA Lite TM PBC Ambígua* Screen IgG/IgA ELISA Negativo *Os resultados ambíguos foram excluídos da análise 5

6 A concordância Positiva e a concordância Negativa foram calculadas por comparação dos resultados obtidos no PBC Screen com os resultados obtidos nos outros ensaios individuais. Positivo acordo (exclua ambíguas) = 99,5% (437/439) Negativo acordo (exclua ambíguas) = 98,9% (730/738) Global acordo (exclua ambíguas): = 99,2% (1167/1177) Reactividade cruzada O soro de 463 doentes com doença do fígado não-cbp (213 com AIH-1, 48 com PSC, 10 com AIH/PSC, 8 com AIC, 9 com hepatite criptogénica, 11 com VBDS, 3 com AIH-2, 11 com doença alcoólica do fígado, 1 com hepatite induzida por drogas, 71 com HBV e 78 com HCV) e 29 doentes com doença infecciosa ou auto-imune (7 com H. pylori, 3 com ASCA, 4 com ANA, 3 com ttg, 2 com GPA, 2 com GBM e 8 com CMV) foram testados com QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA para avaliar a especificidade do ensaio. Do grupo da doença infecciosa/auto-imune (29 doentes) apenas uma amostra CMV positiva foi interpretada como positiva (34,4 unidades) no PBC Screen. Este doente teve uma coloração citoplasmática e nuclear fraca no IFA mas não específica para qualquer um dos padrões de antigénio CBP. No grupo não-cbp, compreendendo 463 doentes, 53 doentes foram positivos no PBC Screen. 42 dos 53 doentes positivos mostraram alguma reactividade em um, ou mais, testes individuais, enquanto que 9 dos doentes foram negativos para todos os marcadores. É possível que os 53 doentes positivos do grupo não-cbp possam ter uma sobreposta CBP não diagnosticada ou em desenvolvimento. Precisão e Reprodutibilidade O desempenho dos vários ensaios (intra-ensaios) foi avaliado fazendo-se correr 7 espécimes, no kit de controlo positivo elevado (HPC) e no controlo negativo (NC), cinco vezes cada. Tableau 2 : Desempenho entre ensaios do ELISA QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA CPH CN A B C D E F G Unidades médias 100,6 1,1 61,6 39,8 27,9 13,6 27,5 26,5 23,6 Desvio padrão 2,2 0,1 2,3 1,0 0,8 0,3 0,9 0,6 0,5 Coeficiente de variação % 2,2 6,5 3,7 2,4 3,0 2,4 3,2 2,2 2,2 Tabela 3: Tabela 3: Desempenho inter-ensaios do ELISA QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA CHP CN A B C D E F G H Unidades médias 104,8 1,6 67,5 8,4 29,7 35,2 6,3 31,5 29,8 25,2 Desvio padrão 1,9 0,3 1,7 0,3 1,2 0,6 0,6 1,9 1,3 0,25 Coeficiente de variação% 1,8 21,9 2,6 3,6 4,0 1,6 9,2 6,1 4,5 1,0 O desempenho dos vários ensaios (inter-ensaios) foi avaliado testando-se 8 espécimes, em duplicado, no kit de controlo positivo elevado (HPC) e no controlo negativo (NC), duas vezes ao dia (uma vez pela manhã e outra pela tarde) durante 3 dias. cinco vezes cada. Referências 1. Heathcote EJ. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 2000;31: Kaplan MM, Gershwin ME. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 2005;353: Feld JJ, Heathcote EJ. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 2003;18: Talwalkar JA, Lindor KD. Primary biliary cirrhosis. Lancet 2003;362:53: Jones DE, Watt FE, Metcalf JV, Bassendine MF, James OF. Familial primary biliary cirrhosis reassessed; a geographically-based population study. J Hepatol 1999;30: Kim W.R. et.al Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology (2000) 119, Kisand KE, Metskula K, Kisand KV, Kivik T, Gershwin ME, Uibo R. The follow-up of asymptomatic persons with antibodies to pyruvate dehydrogenase in adult population samples. J Gastroenterol 2001;36: Metcalf JV, Mitchison HC, Plamer JM, Jones DE, Bassendine MF, James OF. Natural history early primary biliary cirrhosis. Lancet 1996;348: Prince M, Chetwynd A, Newman W, Metcalf JV, James OF. Survival and symptom progression in a geographically based cohort with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 2002:123: Fussey SP, Guest JR, James OF, Bassendine MF, Yeaman SJ. Identification and analysis of the major M2 autoantigens in primary biliary cirrhosis. Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Moteki S, Leung PS, Cappel RL, Dickson ER, Kaplan MM, Munoz S, Gershwin ME. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 1996;24:

7 12. Miyakawa H, Tanaka A, Kikuchi K, Matsushita M, Kitazawa E, Kawaguchi N, Fujikawa H, et al. Detection of antimiochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMA-negative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantibodies autoantigens. Hepatology 2001;34: Milkiewicz P, Buwaneswaran H, Lee L, Coltescu C, Shums Z, Norman GL, Heathcote EJ. Value of "new" autoantibody testing in the differential diagnosis of autoimmune liver conditions. Hepatology 2005;42:292A. 14. Tanaka A, Nalbandian G, Leung PS, Benson GD, Munoz S, Findor JA, Branch AD, et al. Mucosal immunity and primary biliary cirrhosis: presence of antimitochondrial antibodies in urine. Hepatology 2000;32: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), CLSI (NCCLS). Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline- 2 nd edition NCCLS Document C24-A2, Vol. 19(5), Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service PRT June 2009 Revision 1 7