NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI Para Utilização em diagnósticoin Vitro Complexidade CLIA: Elevada
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- Henrique Carvalhal da Mota
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1 NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI Para Utilização em diagnósticoin Vitro Complexidade CLIA: Elevada Código do produto Aplicação diagnóstica NOVA Lite HEp-2 é um ensaio imunofluorescente indireto para o rastreio e a determinação semiquantitativa de anticorpos antinucleares (ANA) em soro humano. A presença de anticorpos antinucleares pode ser utilizada em conjunto com outros testes serológicos e conclusões clínicas para ajudar ao diagnóstico de lúpus eritematoso sistémico (LES) ou outras doenças do tecido conjuntivo ou reumáticas. Resumo e Explicação do teste O termo "anticorpos antinucleares" descreve uma variedade de autoanticorpos que reagem com constituintes dos núcleos da célula, incluindo ADN, RNA e várias proteínas e ribonucleoproteínas. 1 Estes anticorpos ocorrem com elevada frequência em doentes com doenças do tecido conjuntivo ou reumáticas, especialmente lúpus eritematoso sistémico. Virtualmente, todos os doentes com LSE são ANA positivos. Esta sensibilidade do diagnóstico conduziu à inclusão de testes de ANA nos Critérios Revistos de 1982 para a Classificação de Lúpus Eritematoso Sistémico por uma subcomissão do American College of Rheumatology. 2 Embora o teste de ANA seja um excelente teste de rastreio para LES (virtualmente, um resultado negativo exclui o LES ativo 3 ), não é de modo algum um teste específico. Os doentes com outras doenças do tecido conjuntivo, como artrite reumatóide, esclerodermia e dermamiosite são frequentemente positivos e podem observar-se títulos de ANA baixos noutras fases da doença e na população normal. Os resultados positivos de ANA podem ocorrer no seguimento de queimaduras graves ou infeção viral e foram observados em algumas pessoas normais e saudáveis, particularmente em populações mais idosas. Devido a esta falta de especificidade, recomenda-se que todas as amostras positivas de ANA sejam tituladas até ao título final e que se realizem testes mais específicos para autoanticorpos para ADN de cadeia dupla (dsdna) e autoanticorpos do antigénio antinuclear extraível (ENA). A imunofluorescência indireta é o método de referência para o teste de ANA. Os substratos comuns são secções finas de órgãos de roedores ou vários tipos de linhas de células. É comum concordarse que os substratos da linha de células são preferíveis às secções de órgãos, uma vez que estas células de divisão rápida têm níveis superiores de determinados antigénios clinicamente relevantes, incluindo o centrómero SS-A(Ro), Scl-70 e a PCNA/Ciclina. Para além do tipo de substrato, três outros fatores são cruciais para o desempenho de um teste de ANA: 1) o fixador usado para a preparação da lâmina, 2) a fluoresceína para rácio de proteína (F/P) e 3) a especificidade da subclasse da imunoglobulina do conjugado. Sabe-se que alguns fixadores ou combinações presentes destroem determinados antigénios nucleares e deve evitar-se a sua utilização. A sensibilidade e a coloração de fundo não específica de um conjugado são determinadas pelo rácio F/P, ao passo que a especificidade de doença de um conjugado é determinada pela reatividade da subclasse da imunoglobulina. Virtualmente, todos os autoanticorpos clinicamente significativos exibem especificidade da subclasse IgG, mesmo na presença de ANA específicos de IgM e IgA. 4 Por oposição, o ANA encontrado em dadores de sangue saudáveis é, geralmente, apenas da subclasse IgM e IgA. 5 Por isso, os conjugados específicos para IgG são mais específicos da doença. O substrato escolhido para NOVA Lite HEp-2 ANA fixa-se idealmente na linha de células epiteliais (HEp-2) humanas e o conjugado é purificado por afinidade no IgG anti-humano, possuindo um rácio F/P selecionado cuidadosamente. Estes parâmetros do reagente permitem ao teste NOVA Lite HEp-2 ANA detetar autoanticorpos clinicamente relevantes (incluindo o SS-A e o Scl-70), que podem não ser detetados por alguns outros testes de ANA comercializados. Para além disso, a especificidade do conjugado IgG elimina resultados positivos falsos fisiológicos devido à ocorrência normal de autoanticorpos IgM de título baixo, encontrados frequentemente em pessoas mais idosas mas saudáveis. Princípio do procedimento Na técnica de imunofluorescência indireta, as amostras são incubadas com substrato de antigénio e os anticorpos sem reação são lavados. O substrato é incubado com conjugado marcado de fluoresceína específico e, em seguida, o reagente não ligado é lavado. Quando visto através de um microscópio de fluorescência, as amostras positivas de autoanticorpos exibem uma florescência verde maçã correspondente a áreas da célula ou dos núcleos onde o autoanticorpo estava ligado. 2 1
2 Reagentes Lâminas de substrato HEp-2 (célula epitelial humana); 12 poços/lâmina, com dessecante Conjugado IgG Anti-humano (Cabra), fluoresceína marcada em solução tampão contendo DAPI e,09% de azida de sódio Controlo Padrão de Título Final ANA, 1 frasco com solução tampão contendo 0,09% de azida de sódio e anticorpos de HEp-2 de soro humano pré-diluídos. Controlo Negativo Sistema IFA, 1 frasco com solução tampão contendo 0,09% de azida de sódio e em anticorpos de HEp-2 de soro humano pré-diluídos. Concentrado PBS II (40x), suficiente para 2000 ml Meio de Montagem, 0,09% de azida de sódio Lamelas Advertências 1. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos do kit para este produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos de HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum método de teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infeciosos. Portanto, o Controlo Padrão de Título Final ANA e o Controlo Negativo do Sistema IFA devem ser manipulados da mesma forma que qualquer material potencialmente infecioso A Azida de Sódio é utilizada como conservante em alguns componentes do kit. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 3. Usar equipamento de proteção individual apropriado para trabalhar com os reagentes. 4. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Este produto destina-se à Utilização para Diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. A lavagem incompleta ou ineficiente dos poços IFA pode causar elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de fatores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Estes incluem a temperatura inicial dos reagentes, a resistência da lâmpada do microscópio usada, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e a duração dos tempos de incubação durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. Com o tempo, a cor do Conjugado IgG Anti-humano pode alterar-se devido à exposição à luz. No ntanto, a alteração da cor não afeta o desempenho do ensaio. 7. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes do kit a 2-8 C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. A solução tampão PBS II diluída é estável durante 4 semanas a 2-8 C. Colheita da amostra Este procedimento deve ser efetuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras de soro muito hemolizadas ou lipémicas devem ser evitadas. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A3 da CLSI (NCCLS) recomenda as seguintes condições de conservação para as amostras: 1) Não conservar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8 ºC. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20 ºC ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. 2
3 Procedimento Materiais fornecidos Item fornecido Lâminas de Substrato HEp-2 de 12 poços Conjugado IgG Anti-humano FITC com DAPI Quantidade 20 x 12 poços 1 x 15 ml Controlo Padrão de Título Final NA 1 x 0,5 ml Controlo Negativo de Sistema FA 1 x 0,5 ml Concentrado PBS II (40x) 2 x 25 ml Meio de Montagem 1 x 7 ml Lamelas 1 x 20 Materiais adicionais necessários mas não fornecidos Micropipetas de μL de volume Água destilada ou desionizada Frascos de apertar ou pipetas Pasteur Câmara húmida Recipiente de 1L (para diluir o PBS II) Frasco Coplin Microscópio de fluorescência com excitador de 495nm e filtro de barreira de 515nm Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e bem misturados. 2. Diluir o Concentrado PBS II: IMPORTANTE: Diluir o Concentrado PBS II 1:40, adicionando o conteúdo do frasco do Concentrado PBS II a 975 ml de água destilada ou desionizada e misturar cuidadosamente. Utiliza-se a solução tampão PBS II para diluir amostras do doente e como um tampão de lavagem. Pode conservar-se a solução tampão diluída durante 4 semanas a 2-8 C. 3. Diluir as Amostras do Doente: a. Rastreio inicial: Diluir as amostras do doente a 1:40 com solução tampão PBS II diluído (ou seja, adicionar 50μL de soro a 1,95mL de solução tampão PBS II). b. Titulação: Fazer duas vezes diluições de série a partir da diluição de teste inicial para todas as amostras positivas com solução tampão PBS II (ou seja, 1:80, 1:160,... 1:2560). Procedimento de Ensaio 1. Preparar Lâminas de Substrato: Deixar que a lâmina de substrato atinja a temperatura ambiente antes de retirar da bolsa. Rotular com lápis e colocá-la numa câmara húmida adequada. Adicionar uma gota (20-25μL) do controlo positivo e do controlo negativo não diluídos aos poços 1 e 2 respetivamente. Adicionar uma gota (20-25μL) de amostra do doente diluída aos poços restantes. 2. Incubação da Lâmina: Incubar a lâmina durante 30 ± 5 minutos numa câmara húmida (um guardanapo de papel humedecido colocado estendido no fundo de um recipiente de plástico ou vidro fechado) manterá as condições de humidade adequadas. Não deixar que o substrato seque durante o procedimento de ensaio. 3. Lavagem das Lâminas: Após a incubação, utilizar um frasco de plástico de apertar ou pipetar para lavar suavemente o soro com solução tampão PBS II diluída. Orientar a lâmina e o fluxo de solução tampão PBS II de forma a minimizar a lavagem de amostras entre poços. Evitar dirigir o fluxo diretamente para os poços para evitar causar danos ao substrato. Se desejar, colocar as lâminas num frasco Coplin de solução tampão PBS II diluída até 5 minutos. 4. Adição de Conjugado Fluorescente: Agitar a solução tampão PBS II em excesso. Colocar novamente a lâmina na câmara húmida e cobrir imediatamente cada poço com uma gota de conjugado fluorescente. Incubar as lâminas durante mais 30 ± 5 minutos. 5. Lavagem das Lâminas: Repetir o Passo 3. 3
4 6. Lamela: Os procedimentos com lamelas variam de laboratório para laboratório; no entanto, recomenda-se o procedimento seguinte: a. Colocar uma lamela sobre um guardanapo de papel. b. Aplicar meio de montagem numa linha contínua na extremidade inferior da lamela. c. Agitar a solução tampão PBS II em excesso e tocar com a extremidade inferior da lâmina na extremidade da lamela. Baixar suavemente a lâmina sobre a lamela, de forma que o meio de montagem corra para a extremidade superior da lâmina sem formação ou bloqueio de bolhas de ar. Controlo de qualidade O Controlo Padrão de Título Final ANA e o Controlo Negativo do Sistema IFA devem ser testados em todas as lâminas para garantir que todos os reagentes e procedimentos são executados corretamente. Outros controlos adequados podem ser preparados efetuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -70 C. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, os resultados do teste devem ser considerados inválidos e o ensaio repetido. 1. O Controlo Padrão de Título Final ANA não diluído tem de ser > O Controlo Negativo do Sistema IFA tem de ser negativo. Interpretação dos resultados Reação negativa. Uma amostra é considerada negativa se a coloração específica for igual ou inferior ao Controlo Negativo do Sistema IFA. As amostras podem exibir vários graus de coloração de fundo devido aos anticorpos heterófilos ou a autoanticorpos de nível baixo para constituintes citoplásmicos, como as proteínas contráteis. Reação positiva. Uma amostra é considerada positiva se a coloração específica for igual ou inferior ao Controlo Negativo do Sistema IFA. Determine o grau de fluorescência ou a intensidade utilizando estes critérios: 4+ Fluorescência verde maçã brilhante 3+ Fluorescência verde maçã viva 2+ Fluorescência positiva manifestamente distinta 1+ Fluorescência específica mais baixa que permita à coloração nuclear e/ou citoplásmica ser claramente diferenciada da fluorescência de fundo. Interpretação do Padrão. Podem exibir-se vários padrões de coloração nuclear e/ou citoplásmica, dependendo dos tipos e das quantidades relativas de autoanticorpos presentes na amostra. Podem observar-se os seguintes tipos de padrões de coloração: Homogéneo: uma coloração sólida do núcleo, com ou sem máscara aparente dos núcleos. Antigénios nucleares presentes: dsdna, ssdna, histonas Associação com a doença: títulos elevados sugerem LES; títulos mais baixo sugerem LES ou outras doenças do tecido conjuntivo. Periférica: uma coloração sólida, principalmente em volta da região exterior do núcleo, com coloração mais fraca na direção do centro do núcleo. Antigénios nucleares presentes: dsdna, ssdna, DNP, Histona Associação com a doença: títulos elevados sugerem LES; títulos mais baixo sugerem LES ou outras doenças do tecido conjuntivo. Salpicado: uma coloração fina ou com aspeto granuloso do núcleo, geralmente sem coloração fluorescente dos núcleos. Antigénios nucleares presentes: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B e outros sistemas de antigénio/anticorpo ainda não caracterizados. Associação com a doença: títulos elevados sugerem LES (anticorpo Sm), doença mista do tecido conjuntivo (anticorpo RNP), esclerodermia (anticorpo Scl-70), ou complexo do síndrome seco de Sjögren (anticorpo SS-B); títulos mais baixos podem sugerir outras doenças do tecido conjuntivo. Nucleolar: coloração salpicada grossa grande dentro do núcleo, geralmente inferior a 6 em número por célula, com ou sem salpicos finos ocasionais. Antigénios nucleares presentes: 4-6S RNA e outros antigénios nucleares desconhecidos. Associação com a doença: títulos elevados são prevalecentes em esclerodermia e síndrome de Sjogren. 4
5 Centrómero: um padrão de coloração salpicada, discreta. Os salpicos nucleares são muito discretos e, geralmente, em alguns múltiplos de 46. Antigénios nucleares presentes: centrómero cromossomático (cinetócoro). Associação com a doença: altamente sugestivo de síndrome de CREST, uma forma de esclerose sistémica progressiva (ESP). CREST é uma forma de ESP sem calcinose proeminente, bem como de fenómeno de Raynaud, dismotilidade esofágica e envolvimento limitado da pele (frequentemente limitada aos dedos ou à face), telangiectasia. Mitocondrial: um salpico discreto do citoplasma com escassez relativa da área nuclear. Antigénio presente: vários tipos de antigénios mitocondriais. Associação com a doença: títulos elevados indicam cirrose biliar primária. É importante avisar o utilizador para ter cuidado ao confiar em padrões para determinar a especificidade do autoanticorpo, exceto para os padrões nucleolar e centrómero, nos quais cada um dos antigénios está muito bem definido e os seus padrões são característicos. Uma vez que muitos autoanticorpos ou combinações podem induzir um padrão homogéneo ou salpicado, recomenda-se realizar o teste de autoanticorpo de seguimento específico (como para dsdna e ENA) em todas as amostras salpicadas ou homogéneas. Limitações do procedimento 1. ANA de título elevado sugere doença do tecido conjuntivo, mas não deverá considerar-se diagnóstico. O resultado do ANA deverá ser considerado em combinação com outros resultados serológicos, bem como o historial clínico geral do doente. 2. Os padrões ANA mudam frequentemente, à medida que a amostra é titulada até ao título final. Este fenómeno deve-se ao fato de os anticorpos de título mais baixo descerem abaixo da sensibilidade do sistema à medida que mais amostra diluída é testada. 3. Vários fatores externos influenciam a sensibilidade do teste, incluindo o tipo de microscópio de fluorescência usado, a resistência e a antiguidade da lâmpada, a ampliação usada, o sistema de filtro e o observador. 4. Se se usar um filtro de passagem de banda em vez de um filtro de barreira 515, pode observarse coloração artifatual aumentada. 5. Para rotular as lâminas só pode usar-se um lápis. A utilização de qualquer outro utensílio de escrita pode causar coloração artifatual. 6. Todos os frascos Coplin usados para lavagem da lâmina não deverão conter qualquer resíduo de corante. A utilização de frascos Coplin com resíduos de corante pode causar coloração artifatual. 7. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos. 8. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro. As lâminas vendidas separadamente estão classificadas como Reagentes específicos do analito. Exceto como um componente do Kit NOVA Lite HEp-2 ANA com DAPI, as características analíticas e de desempenho não estão estabelecidas. Valores esperados Utilizando o Kit de Teste NOVA Lite HEp-2 ANA, testaram-se vários doentes com doença do tecido conjuntivo, bem como 200 dadores de sangue aleatórios. Os resultados encontram-se abaixo: Grupo de doentes Número testado Número de positivos SLE Lúpus Induzido por Medicação Artrite reumatóide Esclerodermia Dermatomiosite Síndrome de Sjogren Normal
6 Referências 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: , Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009 Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT December 2012 Revision 2 NOVA Lite e INOVA Diagnostics, Inc. são marcas comerciais registadas. Copyright 2012 Todos os Direitos Reservados 6
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