QUANTA Lite ACA IgM III Para Diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada

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1 QUANTA Lite ACA IgM III Para Diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação diagnóstica QUANTA Lite ACA IgM (HRP) é um ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção semi-quantitativa de anticorpos IgM anti cardiolipina no soro humano. A presença de anticorpos anti cardiolipinas, pode ser utilizada em conjunto com o resultado de outros testes serológicos e a história clinica do doente para ajudar a determinar o risco de trombose, em individuos com Lupus Eritematoso Sistémico (LES) ou outras desordens semelhantes ao lupus. Resumo e Explicação do teste Os anticorpos anti cardiolipina (ACA) têm sido fortemente associados com tromboses venosas e arteriais. 1 Estas descobertas foram primeiro observadas durante estudos no Lupus Eritematoso Sistémico, (LES) uma doença em que um dos muitos sintomas inclui a trombose. Dos muitos autoanticorpos encontrados no LES, dois deles descobriu-se serem contra fosfolipidos como a cardiolipina. 2 Princípio do método Os poços da microplaca de poliestireno, encontram-se revestidos com antigénios purificados de cardiolipina, sob condições que vão preservar o antigénio no seu estado nativo. Os controlos pré diluidos e as amostras diluidas são pipetados nos diferentes poços, permitindo que os anticorpos especificos anti-cardiolipina presentes se liguem ao antigénio imobilizado. Depois de proceder á lavagem dos poços, para retirar a amostra não ligada, adiciona-se o conjugado IgM anti humano marcado. Durante a segunda incubação o conjugado liga-se aos anticorpos das amostras retidos nos poços. Depois da segunda lavagem, para retirar o excesso de conjugado, adiciona-se o substrato cromogénico que provoca uma alteração da cor na presença do Conjugado. Após adição da solução de paragem a presença ou ausência de anticorpos anti-cardiolipina é determinada por comparação da densidade óptica da amostra com a densidade óptica dos 5 pontos da curva de calibração. Os resultados são apresentados semi-quantitativamente em unidades padrão anti-cardiolipina IgM (MPL). Composição do dispositivo 1. Placa de micropoço de poliestireno ELISA revestido com o antígeno cardiolipina purificado e β 2 GPI bovino (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo Negativo ACA, 1frasco de tampão com conservantes e soro humano sem anticorpos humanos anti 3. Controlo ACA IgM III, 1frasco de tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti 4. Calibrador A - ACA IgM III, 1frasco de tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti 5. Calibrador B ACA IgM III, 1frasco de tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti 6. Calibrador C - ACA IgM III, 1frasco de tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti 7. Calibrador D - ACA IgM III, 1frasco de tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti 8. Calibrador E - ACA IgM III, 1frasco de tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti 9. Diluente da amostra ACA III, 1 frasco cor de rosa contém tampão salino PBS, estabilizadores proteicos e conservantes, 50ml 10. PBS ACA III concentrado, 1frasco 40x concentrado, de cor vermelha com tampão salino PBS, 25ml. As instruções de diluição encontram-se na secção Método. 11. Conjugado HRP IgM, (de cabra), anti humano IgM, 1frasco de cor verde com tampão, estabilizadores proteicos e conservantes, 10ml 12. Cromogénio TMB, 1 frasco com conservantes, 10ml 13. Solução de paragem HRP, Ácido Sulfurico 0,344M, 1 frasco incolor, 10ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um quimico (0,02% cloranfenicol) no conjugado; considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana, utilizado na preparação dos controlos para este produto foi testado e deu resultados negativos para testes aprovados pela FDA em relação a anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência destes anticorpos ou outros agentes infecciosos. Assim os controlos e calibradores ACA devem ser manipulados como material potencialmente infectante A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é considerado venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. Pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão ao deitarmos fora os restos de reagentes devemos deixar correr água em quantidade suficiente para evitar a formação destas substâncias. 4. O conjugado HRP contém um quimico diluido venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras quimicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele ou olhos. 1

2 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluido. Evitar a exposição com bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras quimicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais no que respeita à eliminação dos produtos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituiçao de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada dos poços ELISA e a aspiração insuficiente dos poços pode originar baixa precisão ou uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação da técnica a processadores automáticos ou outros aparelhos, total ou parcialmente, pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório validar os seus procedimentos automáticos. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços, o fotómetro utilizado para a leitura, e a duração das incubações. Estes factores devem ser suficientemente consistentes para que se obtenham resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma inadequada selagem da saqueta pode provocar a degradação do Antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser obtidas quando usamos duas ou mais vezes o mesmo frasco de conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do conjugado para evitar estas ocorrências. 9. A contaminação quimica do conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Residuos comuns do laboratório como a formalina, lexivia, etanol ou detergentes provocam a degradação do conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes quimicos. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até á data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras da microplaca que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original e conservadas a 2-8 ºC. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8ºC. Colheita da Amostra Este procedimento deve ser efectuado com soro. A adição de azida de sódio ou de outros conservantes às amostras pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visiveis não devem ser utilizadas. Amostras hemolizadas ou lipémicas devem ser evitadas. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A3 da CLSI (NCCLS) recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. Procedimento Material fornecido 1 Microplaca ELISA Cardiolipina (12-1x 8 poços), com suporte 1 1,2ml Controlo negativo ACA, pré-diluido 1 1,2ml Controlo ACA IgM III, pré-diluido 1 1,2ml Calibrador A - ACA IgM III, pré-diluido 1 1,2ml Calibrador B - ACA IgM III, pré-diluido 1 1,2ml Calibrador C - ACA IgM, III pré-diluido 1 1,2ml Calibrador D - ACA IgM III, pré-diluido 1 1,2ml Calibrador E - ACA IgM III, pré-diluido 1 50ml Diluente da amostra ACA III 1 25ml PBS ACA III concentrado, 40x concentrado 1 10ml Conjugado HRP IgM, (de cabra), IgM anti-humano 1 10ml Cromogénio TMB 1 10ml Solução de paragem HRP, Ácido Sulfurico 0,344M 2

3 Material necessário não fornecido com o kit: Micropipetas de 5, 100, e 500 μl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos para diluições de 4 ml de volume Água destilada ou desionizada Contentor de 1L para diluir o PBS ACA III concentrado Fotometro para leitura de microplaca, com filtro de 450 nm e 620 nm (para leituras duplas de comprimento de onda) Método Antes de Iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se á temperatura ambiente (20-26ºC) antes de usar, misturar bem. 2. Diluir o PBS ACA III concentrado 1:40, adicionando o conteúdo do frasco a 975 ml de àgua destilada ou desionizada. Se não se utilizar a placa toda, pode prepara-se quantidades menores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de àgua destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. 3. Preparar as amostras diluindo os soros 1:101 no diluente ACA das amostras; adicionar 5 μl de amostra a 500 μl de diluente. As amostras devem ser usadas nas 8 horas seguintes á sua diluição. NÃO DILUIR os Calibradores ACA IgM III A-E, o Controlo ACA IgM III nem o Controlo Negativo ACA. 4. A determinação de anticorpos anti cardiolipina requer o uso de 2 poços para cada calibrador e controlos, e um ou dois poços para cada amostra. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. 5. Preparação da curva de calibração: utilizar os calibradores pré diluidos ACA IgM III A-E directamente do frasco. Os 5 pontos da curva apresentam os seguintes valores: Ponto Unidades Fosfolipidos (MPL) A Calibrador A ACA IgM III, pré diluido 150,0 B Calibrador B ACA IgM III, pré diluido 75,0 C Calibrador C ACA IgM III, pré diluido 37,5 D Calibrador D ACA IgM III, pré diluido 18,8 ou 18,75 E Calibrador E ACA IgM III, pré diluido 9,4 ou 9,375 Técnica 1. ANTES DE INICIAR TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE Á TEMPERATURA AMBIENTE (20-26ºC). Colocar na placa o número de strips necessário. Guardar imediatamente as restantes estripes na saqueta e selar convenientemente para minimizar a exposição ao vapor de àgua. 2. Pipetar 100 μl de cada um dos 5 calibradores, das amostras diluidas, do controlo negativo ACA e do controlo ACA IgM III para os poços. NOTA: tanto o controlo ACA IgM III como o controlo negativo ACA estão pré diluidos e prontos a usar. O valor e o intervalo aceitável do controlo ACA IgM III estão impressos no rótulo do frasco. Se o valor obtido para o controlo se encontrar fora do intervalo aceitável impresso no rótulo, repetir o ensaio. Se em testes repetidos o valor do controlo cair fora do valor indicado, contactar os serviços técnicos da INOVA para assistência. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. 3. Tapar os poços e incubar durante 30 minutos á temperatura ambiente. A incubação inicia-se após adição da ultima amostra. 4. Lavagem: Aspirar os pocitos. Adicionar μl de tampão ACA III PBS diluido e aspirar novamente. Repetir esta sequencia mais 2 vezes num total de 3 lavagens. Após a ultima lavagem, inverter a placa em papel absorvente para retirar todo o liquido residual. É importante esvaziar completamente os poços em cada passo do procedimento de lavagem. Manter a mesma sequência para a lavagem conforme a sequência anteriormente utilizada para a adição das amostras. 5. Pipetar 100 μl do conjugado HRP IgM em cada pocito. O conjugado deve ser removido do frasco, usando condições padrão de assépsia e boas práticas de laboratório. Retirar apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUIMICA, NUNCA RECOLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Incubar os poços durante 30 minutos, como no ponto Lavagem:Repetir o ponto Dispensar 100 μl do cromogénio TMB em cada pocito e incubar durante 30 min, no escuro e á temperatura ambiente. 8. Adicionar 100 μl de solução de paragem HRP em cada pocito. Manter a mesma sequência para a adição da solução de paragem HRP, conforme a sequência anteriormente utilizada para a adição do cromogénio TMB. Agitar cuidadosamente a placa para uma mistura homogénea. 9. Ler a densidade optica (DO) a 450 nm no espaço de 1 hora após para a reacção. Se fizer leitura bicromática, pode usar-se 620 nm como comprimento de onda de referência. Controlo de Qualidade 1. O Controlo ACA IgM III, os calibradores ACA IgM III e o Controlo Negativo ACA devem ser introduzidos em todos os ensaios, para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuaram correctamente. 2. Uma vez que o Controlo ACA IgM III, os Calibradores ACA IgM III e o Controlo Negativo ACA são pré diluidos, o procedimento de diluição não é controlado. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com directivas ou requerimentos nacionais ou de acordo com organizações acreditadas. Outros controlos podem ser preparados a partir de aliquotas de soro humano, conservados a -20ºC. 4. De forma a considerar validos os resultados dos testes, todos os critérios defenidos devem ser respeitados. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. 3

4 a. A absorvância do Calibrador A ACA IgM III pré-diluido deve ser superior á absorvância do Controlo ACA HRP IgM pré-diluido, que deve ser superior á absorvância do Controlo Negativo ACA prédiluido. b. O Calibrador A ACA IgM III pré-diluido deve ter uma absorvância superior a 1,0 enquanto o Controlo Negativo ACA pré diluido não pode ter um absorvância superior a 0,2. c. A absorvância do Controlo ACA IgM III deve ser mais do dobro da absorvância do Controlo Negativo ACA ou superior a 0,25. d. A concentração do Controlo ACA IgM III tem de se encontrar dentro dos limites defenidos no seu rótulo. e. O utilizador deve recorrer ao CLSI (NCCLS) documento C24-A3 para outras directivas sobre as práticas de Controlo de Qualidade apropriadas. Cálculo dos Resultados 1. Determinar o valor médio das leituras efectuadas em duplicado. 2. Fazer a curva de calibração, colocar a absorvância média dos calibradores contra o log das suas concentrações. Desenhar a melhor linha entre os pontos. Pode ser utilizado em alternativa um gáfico log/log. As unidades MPL dos calibradores encontram-se no frasco dos calibradores. 3. Determinar as concentrações desconhecidas das amostras no eixo do X por leitura da absorvância correspondente no eixo do Y. Interpretação dos Resultados O teste ELISA é muito sensivel á técnica e é capaz de detectar, mesmo pequenas diferenças em populações de doentes. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, baseados nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de acordo com os procedimentos estabelecidos. 1. Um resultado positivo indica a presença de anticorpos IgM anti cardiolipinas, pode ser utilizado em conjunto com o resultado de outros testes serológicos e a história clinica para ajudar a determinar o risco de trombose, em individuos com Lupus Eritematoso Sistémico (LES) ou outras desordens semelhantes ao lupus. 2. Os resultados devem ser expressos em unidades MPL. Baseado na avaliação de 489 amostras normais e 142 amostras positivas para IgG, IgM e/ou IgA de cardiolipina sugerem que um corte de 12,5 MPL foi efectuado. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência. Mesmo utilizando uma curva de calibração podem existir pequenas variações nos resultados e são frequentes resultados falsos positivos. 4 Por esta razão sugere-se que valores entre 12,5 e 20 MPL, inclusive, sejam considerados indeterminados, os resultados positivos devem ser considerados apenas para amostras >20 MPL. Harris e Pierangeli sugerem um método semi-quantitativo alternativo para expressar os resultados. 4 Valores entre MPL devem ser considerados positivos baixos a médios e valores superiores a 80 MPL como positivos altos. 3. Um resultado negativo indica ausência de anticorpos IgM anti cardiolipina ou niveis abaixo do limite de detecção do dispositivo. 4. Sugere-se que os resultados dados pelo laboratório devem incluir uma declaração: Os resultados apresentados foram obtidos com o dispositivo INOVA QUANTA Lite ACA IgM III ELISA. Valores de Cardiolipina IgM obtidos por outros métodos, de outros produtores, não podem ser comparados. A magnitude dos níveis IgM descritos não podem ser correlacionados a um titulo final. Limitações do Método 1. O significado clínico dos ACA em outras doenças além do LES encontra-se ainda em investigação. 2. Em estudos publicados sobre o LES, a incidência de ACA positivo é de 5 a 40% para a IgM. 3. Quando títulos de ACA negativos são encontrados na presença de indicações clínicas, um anticoagulante para lúpus ou outro teste adicional como o anti-β 2 GPI pode ser indicado. 4. O diagnóstico não deve ser efectuado somente com base no valor dos ACA. O resultado deve ser considerado conjuntamente com os sinais clínicos. 5. O tratamento não deve ser iniciado somente com base no valor dos ACA. Indicações clinicas de suporte devem estar também presentes. 6. Uma elevada percentagem de doentes seropositivos de sifilis ou na fase activa da doença apresentam valores elevados de ACA. Devem ser executados testes confirmatórios, para excluir a sifilis. 7. Os ACA podem aparecer transitoriamente durante muitas infecções. Pacientes com resultados positivos de ACA devem ser testados novamente após algum tempo de intervalo. 8. O Factor Reumatóide (FR) pode interferir com a determinação do ACA IgM III. 9. A presença de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente pode causar um aumento do nível de ligação não-específica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio. 10. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro. 11. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos 12. Se o Concentrado ACA III PBS não for aquecido e misturado bem antes da utilização, os resultados poderão ser incoerentes. Valores Esperados Valores normais No total, 489 amostras aleatórias de doadores normais foram testadas para ACA IgM. Desse número, quatorze amostras estavam dentro da faixa indeterminada de 12,5-20 MPL. Nove amostras positivas também foram encontradas durante o teste normal aleatório. Essas amostras foram determinadas como positivos verdadeiros em testes adicionais com outros 510 (k) kits avaliados. 95,3% dos normais foram determinados como menores que 12,5 MPL. 4

5 Sensibilidade e Especifidade Relativa Correlação com a segunda geração de ACA IgM da INOVA Diagnostics Um total de 631 amostras foram testadas tanto na segunda geração de ACA IgM e na terceira geração de ACA IgM. Essas amostras incluem um total de 489 normais mencionados no estudo de intervalo normal, bem como 142 amostras de doentes reconhecidamente indeterminados ou positivos para IgG, IgM e/ou IgA de cardiolipina. Os resultados são resumidos abaixo. QUANTA Lite ACA IgM III (terceira geração) - I Sensibilidade Relativa 94,0% ACA IgM ELISA I* Especificidade Relativa 97,8% segunda geração Eficiência Relativa 93,5% *Indeterminados Curva padrão representativa utilizando IgM Sapporo EY2C9 A seguir é apresentada uma curva padrão utilizando o anticorpo monoclonal Sapporo EY2C9 como padrão. O material é proveniente do laboratório do Dr. Takao Koike. É utilizado no QC das placas de ACA e está disponível no INOVA Diagnostics como um item separado, catálogo número A curva foi preparada pela diluição do EY2C9 1:100 no diluente da amostra de ACA e, em seguida, dissolvendo o material no mesmo diluente. Ponto OD Sapporo Unidades µg/ml A EY2C9 1:100 2,181 0,156 B EY2C9 1:200 1,179 0,078 C EY2C9 1:400 0,568 0,039 D EY2C9 1:800 0,271 0,0195 or 0,02 E EY2C9 1:1600 0,144 0,00975 or 0,0098 F EY2C9 1:3200 0,084 0, or 0,0049 Na curva acima, o corte de 12,5 MPL corresponderia a 0,0195 μg/ml de EY2C9. Cada laboratório precisa estabelecer o seu próprio intervalo normal. Precisão e Reprodutibilidade A precisão entre testes e a reprodutibilidade do teste foi medida testando 2 vezes uma amostra positiva e uma negativa em quatro testes separados durante quatro dias. A precisão dentro do teste e a reprodutibilidade do teste foi medida testando dezasseis cópias positivas e dezasseis negativas num único ensaio. O valor médio, desvio padrão e coeficiente de variação para cada amostra estão descritos na tabela seguinte. Média Média Positiva MPL DP %CV Negativa MPL DP %CV Total 66,0 5,4 8,2% 4,1 0,8 19,1% Dentro do teste 65,0 4,4 6,8% 4,1 0,9 0,2% Entre Testes 67,8 7,5 11,0% 3,9 0,6 15,9% 5

6 Referências 1 Lancet i, , Clinics in Rheumatic Diseases 8, , Centers for Disease Control/National Institutes of Health Manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, The VII th International Symposium on Antiphospholipid Antibodies, October 9-13, Louisiana State University Medical Center. QUANTA Lite e INOVA Diagnostics são marcas registradas Copyright 2011 Todos os Direitos Reservados Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT July 2011 Revision 17 6