QUANTA Lite TM gp Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada

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1 QUANTA Lite TM gp Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica O kit QUANTA Lite TM gp210 é um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) para a detecção semiquantitativa de anticorpos anti-gp210 da classe IgG em soro humano. Este teste tem como objectivo auxiliar no diagnóstico da Cirrose Biliar Primária (PBC). Resumo e Explicação do teste A Cirrose Biliar Primária (PBC) é uma doença crónica do fígado, caracterizada pela destruição dos pequenos ductos de bile intra-hepáticos. A destruição progressiva dos ductos conduz a um prejuízo funcional crescente do fígado e, com o tempo, pode provocar a falha do fígado e tornar necessário o transplante. 1,2 A etiologia da PBC é desconhecida, embora um componente genético, bem como outros factores, podem ser importantes para o desenvolvimento da doença. 1,3,4 A PBC ocorre tipicamente entre as idades de 30 e 65, e afecta mulheres com mais frequência que homens (a proporção feminina:masculina estimada é de 9:1). 1,3 O predomínio da PBC em parentes de primeiro grau de doentes com PBC varia de 1,3 a 6,4%. 3,5,6 A PBC é encontrada em todas as raças, com distribuição mundial. Foram informadas grandes variações em termos de prevalência geográfica da PBC, com estimativas de 2 por no Japão e Austrália a 40 por nos Estados Unidos. 7,8 Os ensaios sorológicos constituem-se numa ajuda importante para o reconhecimento e diagnóstico da PBC, pois muitos anticorpos associados à doença estão presentes antes dos sintomas tornarem-se evidentes. 9 Anticorpos antimitocondriais (AMA), detectados por ensaio de imonofluorescência indirecto (IFA), são os marcadores sorológicos clássicos da PBC. Os AMA são encontrados em até 90-95% dos doentes com PBC. Embora o padrão clássico de IFA seja facilmente interpretável, a interpretação pode ser complexa especialmente quando os anticorpos de outras especificidades também estão presentes. Os alvos principais da reactividade do AMA são as proteínas dos complexos 2-oxo ácido dehidrogenase localizados na membrana mitocondrial. Os ensaios ELISA que objectivam essas proteínas são mais sensíveis que o IFA para a detecção dos AMA. 4,10,11 Mesmo assim, pelo menos 5-10% dos doentes com PBC apresentam resultados negativos para AMA tanto pelo ELISA como pelo IFA. A falha em localizar AMA ou outros marcadores de PBC pode contribuir para o atraso no diagnóstico da PBC e para danos adicionais ao fígado. Cerca de 50% do soro de doentes com PBC contém anticorpos antinucleares (ANA). 12,13 O anticorpo antinuclear especificamente associado à PBC apresenta coloração na borda nuclear ou membrana, característica da proteína de membrana nuclear gp ,14 Esta proteína é parte de um complexo de proteínas que formam poros na membrana nuclear. Anticorpos anti-gp210 podem ser detectados em cerca de 25% de todos os doentes com PBC e 10-50% de doentes com PCB negativos para AMA Embora os anticorpos de gp210 possuam um sensibilidade relativamente baixa para PCB, sua especificidade parece ser maior que 99%. 12,15-17 Para além disso, os anticorpos de gp210 podem identificar um subgrupo de doentes com um desenvolvimento mais grave da doença. 13,18-20 A presença de anticorpos de gp210 podem fortalecer o diagnóstico da PBC onde a apresentação clínica não é clara. A presença de AMA e de anticorpos de gp210 pode preceder o desenvolvimento da doença sintomática. 9,20,21 A capacidade de determinar mais precisamente e mais rapidamente se os doentes estão com PBC permite a monitorização e o início de tratamento precoce, que podem retardar o desenvolvimento da doença. A detecção do padrão de borda nuclear associado aos anticorpos anti-gp210 é normalmente difícil de ser interpretada como resultado de uma coloração concomitante de AMA ou ANA e pode também ser o resultado de especificidades não-gp ,22 A detecção de anti-gp210 por mancha é trabalhoso, tecnicamente exigente e se baseia na interpretação subjectiva da intensidade de banda. 15 Estudos moleculares identificaram um epítopo imunodominante de gp210 na cauda citoplasmática de terminal carboxil da proteína gp210 e permitiu o desenvolvimento de ensaios ELISA para a detecção de anticorpos gp ,17,22,23 Princípio do método Um peptídeo purificado correspondente a uma porção da proteína gp210 está ligado aos poços de uma placa de micropoço de poliestireno. A placa dos micropoços encontra-se revestida com estes antigénios. Os controlos pré-diluídos e o soro diluído dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos centrómero presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG anti-humano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controlo. Reagentes 1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno revestidos com um antigénio peptídeo de gp210 purificado (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos anti gp210, pré-diluído, 1,2 ml 3. Positivo Baixo gp210 ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti g9210, pré-diluído, 1,2 ml 1

2 4. Positivo Alto gp210 ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti gp210, pré-diluído, 1,2 ml 5. Diluente da Amostra HRP, 1 frasco cor-de-rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 6. Solução de Lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 7. Conjugado HRP HS IgG, (de cabra), IgG anti-humana, 1 frasco de cor purpúra com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 8. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 9. Solução de Paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo Baixo gp210 ELISA, o Positivo Alto gp210 ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O Conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O Cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 6. A Solução de Paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a aspiração insuficiente dos líquidos dos poços ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de Conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do Conjugado HRP para evitar estas ocorrências. 9. A contaminação química do conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação do Conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras dos micropoços revestidas com antigénios que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8º C. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C. 2

3 Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A3 da NCCLS recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. Procedimento Material fornecido 1 Placa de micropoços gp210 ELISA (12-1 x 8 poços), com suporte 1 1,2 ml Controlo Negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Baixo gp210 ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Alto gp210 ELISA, pré-diluído 1 50 ml Diluente da Amostra HRP 1 25 ml Solução de lavagem HRP, 40x concentrado 1 10 ml Conjugado HRP HS IgG, (de cabra), IgG anti-humana 1 10 ml Cromogénio TMB 1 10 ml Solução de Paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M Material adicional necessário mas não fornecido Micropipetas de 5, 100, e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para Solução de lavagem HRP diluída Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda) Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de Solução de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantémse estável durante uma semana a 2-8º C. 3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de Diluente da amostra HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR o Positivo Baixo gp210 ELISA, o Positivo Alto gp210 ELISA e o Controlo Negativo ELISA. 4. A determinação da presença ou ausência de gp210 utilizando unidades arbitrárias requer o uso de dois poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. Técnica 1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água. 2. Adicione 100 µl de Positivo Baixo gp210 ELISA, de Positivo Alto gp210 ELISA, do Controlo Negativo ELISA pré-diluídos e das amostras diluídas dos doentes aos poços. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra. 3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione µl de Solução de lavagem HRP diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na adição das amostras. 4. Adicione 100 μl do Conjugado HRP HS IgG a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no passo 2. 3

4 5. Lavagem: Repita o passo Adicione 100 µl do Cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente. 7. Adicione 100 µl de Solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da Solução de paragem HRP, tal como efectuado para o Cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços. 8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm. Controlo de qualidade 1. O Positivo Baixo gp210 ELISA, o Positivo Alto gp210 ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. 2. Uma vez que o Positivo Baixo gp210 ELISA, o Positivo Alto gp210 ELISA e o Controlo Negativo ELISA se encontram pré-diluídos, estes não controlam o procedimento associado à diluição das amostras. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20ºC. 4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do Positivo Alto gp210 ELISA pré-diluído deve ser superior à absorvância do Positivo Baixo gp210 ELISA pré-diluído, que deve ser superior à absorvância do Controlo Negativo ELISA pré-diluído. b. O Positivo Alto gp210 ELISA pré-diluído deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto que o Controlo Negativo ELISA pré-diluído não pode ter uma absorvância superior a 0,2. c. A absorvância do Positivo Baixo gp210 ELISA deve ser mais do dobro da absorvância do Controlo Negativo ELISA ou superior a 0,25. d. O Controlo Negativo ELISA e o Positivo Alto gp210 ELISA servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O Positivo Alto gp210 ELISA não consegue assegurar a precisão no ponto de decisão do ensaio. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A2 da NCCLS para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas. 25 Cálculo dos resultados Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica (DO) média para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode então ser calculada dividindo a DO média da amostra pela DO média (DO) do Positivo Baixo gp210 ELISA. O resultado é multiplicado pelo número de unidades do Positivo Baixo gp210 ELISA que se encontram no rótulo. Densidade óptica da amostra Valor da amostra = x Positivo Baixo gp210 ELISA (unidades) DO do Positivo Baixo gp210 ELISA (unidades) A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num correspondente aumento ou diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de anticorpos não duplica a reactividade). Se for necessária uma quantificação mais exacta dos anticorpos do doente, será necessário efectuar diluições em série das amostras do doente, e a última diluição com resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o título de anticorpos do doente. Interpretação dos resultados O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças nas populações de doentes. Os valores abaixo indicados são apenas valores sugeridos. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, com base nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. As amostras são interpretadas como negativas (negativas do anticorpo IgG para gp210), não conclusivas ou positivas (anticorpo IgG para gp210 detectada) de acordo com a tabela abaixo: Negativa 0,0-20,0 Unidades Não conclusivas 20,1-24,9 Unidades Positiva 25 Unidades 1. O resultado positivo indica a presença de anticorpos IgG para gp210 e sugere a possibilidade de Cirrose Biliar Primária. 2. O espécime com níveis não conclusivos de gp210 IgG não pode ser avaliado relativamente ao estado dos anticorpos. Se as leituras permanecerem indefinidas após a repetição do teste, o resultado deverá ser informado como não conclusivo e/ou uma amostra adicional deverá ser tomada. 3. Um resultado negativo indica a ausência de anticorpos IgG para gp210 ou níveis abaixo do limite de detecção do ensaio. 4

5 4. Os espécimes com leituras DO acima do intervalo legível do leitor da placa podem ser informados como maiores que o DO mensurável mais alto dividido pelo DO positivo inferior vezes 25, ou podem ser diluídos, efectuados novamente e obtido um valor calculado. 5. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório devem incluir a declaração: Os resultados apresentados foram obtidos com o dispositivo INOVA QUANTA Lite TM gp210 ELISA. Valores de gp210s obtidos através de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis de IgG descritos não pode ser correlacionada com um título final. Limitações do método 1. Resultados gp210 negativos não descartam a presença de Cirrose iliar Primária. 2. O resultado de anticorpos de gp210 negativo não descarta a presença de anticorpos de gp210, pois a concentração de anticorpos pode estar abaixo do limite de detecção do ensaio. 3. Um resultado de teste positivo indica apenas a presença de anticorpos para gp210 e não indica necessariamente a presença de Cirrose Biliar Primária. 4. O diagnóstico de Cirrose Biliar Primária requer a documentação cumulativa dos dados do doente, a sua apresentação clínica e outros testes de diagnóstico. 5. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos. 6. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro. Valores esperados A prevalência de PBC varia de estimativas de 2 por no Japão e na Austrália, para 40 por nos Estados Unidos. 7,8 Estudos que utilizam o IFA, mancha e várias metodologias ELISA sugerem que anticorpos anti-gp210 estão presentes em cerca de 26% dos doentes com PBC. 15 A especificidade para PBC está próxima de 100%. 12 Intervalo de valores normais Anticorpos de gp210 em indivíduos saudáveis assintomáticos Um grupo de 236 indivíduos assintomáticos saudáveis foi testado para os anticorpos de gp210 com o ELISA QUANTA Lite TM gp210. Os dados de sexo e idade estavam disponíveis para 188 das amostra, somente o sexo para 28 e dados indisponíveis para 20. As idades variaram de 17 a 73 anos e incluíram 55 homens e 78 mulheres. A especificidade do ensaio foi de 100% (236/236). O valor médio para essa população foi de 3,7 unidades e a mediana foi de 3,4 unidades. Com excepção de uma amostra com um valor de 16,5 unidades, as outras 235 amostras tiveram valores inferiores a 9,2 unidades. Características de desempenho específicas A frequência de anticorpos de gp210 detectada com o ELISA QUANTA Lite TM gp210 em um total de 343 amostras com PBC e 5 com PBC/Hepatite auto-imune (AIH) é mostrada na Tabela 1. A análise tomou os resultados obtidos com o ELISA QUANTA Lite TM gp210 em 3 coortes clínicos. A especificidade geral do ensaio foi de 26,1% (91/348). A especificidade do ensaio foi de 100%. O valor preditivo positivo foi 100% e o valor preditivo negativo foi 62%. Os valores da média e mediana para todos os não PBC ou PBC/AIH foram 3,59 e 3,71, respectivamente. Tabela 1: Sensibilidade do ELISA QUANTA Lite TM gp210 ELISA QUANTA Lite TM gp210 Grupo de doentes n= pos não conclusivo neg PBC PBC/AIH Total Sensibilidade: 26,1% (91/348) O soro de 183 doentes com doenças do fígado diferentes da PBC, doenças auto-imunes e outras condições foram testados com o ELISA QUANTA Lite TM gp210 para avaliar a especificidade do ensaio. Nenhuma amostra não PBC ou não PBC/AIH foi interpretada como positiva pelo ELISA QUANTA Lite TM gp210 como mostra a Tabela 2. A especificidade geral do ensaio ELISA QUANTA Lite TM gp210, incluindo tanto os controlos saudáveis e soros sem PBC foi, portanto, 100% (419/419). Tabela 2: Especificidade do ELISA QUANTA Lite TM gp210 ELISA QUANTA Lite TM gp210 Grupo de doentes n= pos não conclusivo neg HBV HCV SLE AIH AIH Artrite reumatóide Colangiolite esclerótica primária Esclerodermia Normal Total Especificidade (todas as amostras não PBC ou PBC/AIH) = 100% (419/419) Valor positivo preditivo: 100% Valor negativo preditivo: 62% 5

6 Precisão e Reprodutibilidade O desempenho entre ensaios foi avaliado examinando-se 10 amostras num total de 6 vezes cada. Tabela 3: Desempenho entre ensaios do ELISA QUANTA Lite TM gp210 A B C D E F G H I J Mean unit 83,5 113,8 140,8 5,3 5,4 18,6 29,3 21,0 25,0 25,8 SD 2,0 0,9 3,5 0,6 0,6 0,9 0,7 1,2 0,9 1,2 CV % 2,4 0,8 2,5 11,2 11,8 4,8 2,5 5,5 3,0 4,8 O desempenho intre ensaios foi avaliado pelo teste em duplicata, 5 amostras duas vezes diariamente (uma vez pela manhã e uma vez à tarde), durante 3 dias. Tabela 4: Desempenho inter-ensaios do ELISA QUANTA Lite TM gp Mean units 82,9 84,8 117,6 147,0 5,8 SD 2,1 3,0 3,9 6,1 1,0 CV % 2,5 3,5 3,3 4,1 12,1 Referências 1. Kaplan, M. M. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 335: , Heathcote, E. J. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 31: , Talwalkar, J. A., Lindor, K. D. Primary biliary cirrhosis. Lancet 362: 53-61, Vergani, D., Bogdanos, D. P. Positive markers in AMA-negative PBC. Am J Gastroenterol 98: , Jones, D. E., Watt, F. E., Metcalf, J. V., Bassendine, M. F., James, O. F. Familial primary biliary cirrhosis reassessed: a geographically-based population study. J Hepatol 30: , Agarwal, K., Jones, D. E., Bassendine, M. F. Genetic susceptibility to primary biliary cirrhosis. Eur J Gastroenterol Hepatol 11: , Kim, W. R. et al. Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology 119: , Feld, J. J., Heathcote, E. J. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 18: , Metcalf, J. V. et al. Natural history of early primary biliary cirrhosis. Lancet 348: , Miyakawa, H. et al. Detection of antimitochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMAnegative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantigens. Hepatology 34: , Moteki, S. et al. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 24: , Worman, H. J., Courvalin, J. C. Antinuclear antibodies specific for primary biliary cirrhosis. Autoimmun Rev 2: , Muratori, P. et al. Characterization and clinical impact of antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis. Am J Gastroenterol 98: , Fritzler, M. J., Manns, M. P. Anti-mitochondrial autoantibodies. Clin Appl Immunol Rev 3: , Miyachi, K. et al. Profile and clinical significance of anti-nuclear envelope antibodies found in patients with primary biliary cirrhosis: a multicenter study. J Autoimmun 20: , Bandin, O. et al. Specificity and sensitivity of gp210 autoantibodies detected using an enzyme-linked immunosorbent assay and a synthetic polypeptide in the diagnosis of primary biliary cirrhosis. Hepatology 23: , Nickowitz, R. E., Wozniak, R. W., Schaffner, F., Worman, H. J. Autoantibodies against integral membrane proteins of the nuclear envelope in patients with primary biliary cirrhosis. Gastroenterology 106: , Itoh, S. et al. Autoantibodies against a 210 kda glycoprotein of the nuclear pore complex as a prognostic marker in patients with primary biliary cirrhosis. J Gastroenterol Hepatol 13: , Invernizzi, P. et al. Autoantibodies against nuclear pore complexes are associated with more active and severe liver disease in primary biliary cirrhosis. J Hepatol 34: , Miyachi, K. et al. A male patient who developed late-onset primary biliary cirrhosis presenting with antinuclear envelope antibodies. Mod Rheumatol 12: , Prince, M., Chetwynd, A., Newman, W., Metcalf, J. V., James, O. F. Survival and symptom progression in a geographically based cohort of patients with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 123: , Shibata, M. et al. Detection of anti-gp210 antibodies in primary biliary cirrhosis by enzyme-linked immunosorbent assay with a synthesized polypeptide. Progress in Hepatology 5: , Tartakovsky, F., Worman, H. J. Detection of gp210 autoantibodies in primary biliary cirrhosis using a recombinant protein containing the predominant autoepitope. Hepatology 21: , Biosafety in Microbiologal and Biomedical Laboratories. CDC/NIH, Fourth Edition. (HHS Pub.#(CDC) ), National Committee for Clinical Laboratory Standards, Internal Quality Control: Principles and Definitions; Approved Guideline. NCCLS Document C24-A2 11(6):

7 Summary of test procedure Before you begin: 1. Bring all reagents to room temperature (20-26 o C). 2. Dilute the HRP Wash Concentrate 1:40 by adding 975mL of distilled or deionized water to the concentrate. 3. Dilute the patient samples 1:101 with HRP Sample Diluent. Test Procedure: 1. Pipette 100μL of the Low Positive, High Positive, Negative and diluted patient samples into the wells. 2. Incubate at room temperature for 30 minutes. 3. Aspirate the contents of each well. Add μL of diluted wash concentrate and aspirate. Repeat two more times. 4. Add 100μL of Conjugate to each well. 5. Incubate at room temperature for 30 minutes. 6. Aspirate the contents of each well. Add μL of diluted wash concentrate and aspirate. Repeat two more times. 7. Add 100μL of TMB to each well. 8. Incubate the plate at room temperature, in the dark, for 30 minutes. 9. Add 100μL of Stop Solution to each well. 10. Read the plate at 450nm/620nm. Lo Lo HI HI - - P1 P1 P2 P2 Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service PRT October 2005 Revision 3 7