NOVA LiteTM IgG F-Actin Aplicação diagnóstica Resumo e Explicação do teste Princípio do método Reagentes Advertências

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1 NOVA Lite TM IgG F-Actin Apenas para exportação. Não se destina a venda nos Estados Unidos. Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação diagnóstica O kit NOVA Lite TM IgG F-Actin é um teste de ensaio de imunofluorescência indirecta (IFA) em substrato epitelial de intestino de rato para o rastreio e determinação semi-quantitativa de anticorpos IgG anti-f- Actina no soro humano. A presença de anticorpos IgG anti-f-actina pode ser utilizada em conjunto com a história clínica do doente e outros testes de laboratório para ajudar no diagnóstico de doenças hepáticas auto-imunes como a hepatite auto-imune (AIH) e a cirrose biliar primária (PBC). Resumo e Explicação do teste Os auto-anticorpos IgG anti-f-actina são o principal componente dos denominados anticorpos antimúsculo liso (ASMA). 1-6 Estes anticorpos encontram-se em até 80% de pacientes com hepatite auto-imune (AIH) e até 30% dos pacientes com cirrose biliar primária 2,6, mas podem, também, ser encontrados, habitualmente em títulos reduzidos, em indivíduos sem AIH. Os ASMA são heterogéneos e incluem anticorpos de formas filamentosas (F) e globulares (G) de actina, bem como tubulina e filamentos intermédios. 3,4,7 Vários auto-anticorpos encontram-se associados à AIH. No entanto, os anticorpos IgG de F-Actina são os auto-anticorpos mais específicos da AIH. 2,5 Enquanto os testes ELISA IgG F-Actin como, por exemplo, o QUANTA Lite Actin IgG ELISA, permitem a detecção de anticorpos IgG anti-f-actina de forma objectiva e quantificável, alguns laboratórios preferem a metodologia IFA para o rastreio de anticorpos IgG anti-f-actina ou para confirmar a sua presença quando detectados pelas tradicionais secções de tecido rim/estômago/fígado (KSL) de rato. A diferenciação anti-f-actina de outros anticorpos em componentes do músculo liso é, frequentemente, difícil utilizando substratos IFA convencionais como, por exemplo, secções de tecido KSL. 2,5 A identificação de anti-f-actina é uma ajuda importante no diagnóstico de AIH. De momento, não está disponível um método norma de ouro para a discriminação de anti-f-actina de outras reactividades. 1,2 Lâminas realizadas com células epiteliais de intestino de rato preparadas utilizando métodos de crescimento e fixação de proprietário oferecem um novo substrato para a detecção de anticorpos IgG anti-f-actina através de IFA. Este substrato ultrapassa algumas das limitações de outros procedimentos IFA uma vez que o padrão IgG anti-f-actina é diferente e outros anticorpos que causam um padrão de interferência em lâminas KSL não interferem com o substrato de células epiteliais de rato. Princípio do método Na técnica de imunofluorescência indirecta, as amostras são incubadas com o substrato de antigénio e os anticorpos não ligados são lavados. O substrato é então incubado com conjugado marcado de fluoresceína específica seguido de lavagem para remover o reagente não ligado. Quando visto através de um microscópio de fluorescência, as amostras exibem uma florescência verde maçã correspondente a áreas onde o auto-anticorpo estava ligado. Uma amostra é considerada positiva se for observada uma coloração específica nas fibras de F-Actina rodeando a maior parte das células num padrão hexagonal e, por vezes, observado em fibras cruzando as células. Reagentes 1. Lâminas F-Actina; 12 poços/lâmina, com dessecante 2. Conjugado IgG anti-humano (cabra), fluoresceína marcada em solução tampão contendo Azul de Evans e azida de sódio 0,09% 3. Controlo positivo IgG F-Actina, 1 frasco de solução tampão contendo azida de sódio 0,09% e soro humano com anticorpos de F-Actina, pré-diluído 4. Controlo negativo de sistema IFA, 1 frasco de solução tampão contendo azida de sódio 0,09% e soro humano sem anticorpos de F-Actina, pré-diluído 5. Concentrado PBS (40x) 6. Meio de montagem, azida de sódio 0,09% 7. Lamelas Advertências 1. Todos os materiais de origem humana utilizados na preparação de controlos para este produto foram testados e considerados negativos a anticorpos de HIV, HbsAg e HCV por métodos aprovados pela FDA. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o controlo positivo IgG F-Actina e controlo negativo do sistema IFA devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso A azida de sódio é utilizada como conservante. A azida de sódio é venenosa e pode ser tóxica se ingerida através da pele ou dos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. A azida de sódio pode reagir com tubagens de chumbo e de cobre, formando azidas potencialmente explosivas. 1

2 3. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 4. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilização para diagnóstico in vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este kit pode originar resultados inconsistentes. 3. A lavagem incompleta ou inadequada dos poços IFA pode causar uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a potência da lâmpada do microscópio utilizado, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e a duração das incubações durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. O tampão PBS depois de diluído é estável durante 4 semanas a 2-8º C. Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico, muito hemolizadas ou lipémicas não devem ser utilizadas. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A3 da NCCLS recomenda as seguintes condições de conservação para as amostras: 1) Não conservar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. Procedimento Material fornecido 5 Lâminas F-Actina, 12 poços 1 Conjugado IgG anti-humano FITC 7 ml 1 Controlo positivo IgG F-Actina 0,8 ml 1 Controlo negativo de sistema IFA 0,5 ml 2 Concentrado PBS 25 ml (40x) 1 Meio de montagem 7 ml 1 Embalagem de 10 lamelas Material adicional necessário, mas não fornecido Micropipetas de μl de volume Água destilada ou desionizada Garrafas de esguicho ou pipetas de Pasteur Câmara húmida Recipiente de 1 l (para diluição de PBS) Frasco Coplin Microscópio fluorescente com filtro excitador de 495 nm e filtro de barreira de 515 nm Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26º C). 2. Dilua o Concentrado PBS: IMPORTANTE: Diluir o Concentrado PBS 1:40, adicionando o conteúdo do frasco do concentrado PBS a 975 ml de água destilada ou desionizada e misturar cuidadosamente. O tampão PBS é utilizado para a diluição de amostras dos pacientes e como tampão de lavagem. O tampão diluído pode ser conservado até 4 semanas a 2-8 C. 3. Diluir as amostras dos pacientes: a. Rastreio inicial: Diluir amostras dos pacientes 1:40 com tampão PBS diluído (i.e., adicione 50 μl de soro a 1,95 ml de tampão PBS). 2

3 b. Titulação: Realizar diluições de série duplas da diluição de teste inicial para todas as amostras positivas com tampão PBS diluído (i.e. 1:80, 1:160, 1: até título final). Técnica 1. Prepare lâminas de substrato: Permita que a lâmina de substrato atinja a temperatura ambiente antes de a remover da respectiva saqueta. Rotule-a com um lápis e coloque-a numa câmara húmida adequada. Adicione uma gota (20-25 μl) do controlo positivo e controlo negativo não diluídos aos poços 1 e 2 respectivamente. Adicione uma gota (20-25 μl) de amostra do paciente não diluída aos poços restantes. 2. Incubação da lâmina: Incubar a lâmina durante 30 ± 5 minutos numa câmara húmida (uma toalha de papel humedecida colocada na parte inferior de um saco de plástico fechado ou recipiente de vidro mantém as condições de humidade adequadas). Não permitir que o substrato seque durante o ensaio. 3. Enxaguar as lâminas: Após a incubação, utilize uma garrafa de esguicho de plástico ou pipeta para lavar suavemente o soro com tampão PBS diluído. Oriente a lâmina e fluxo de tampão PBS de forma a minimizar a lavagem de amostras entre poços. Evite dirigir o fluxo directamente para os poços para evitar danos no substrato. Se desejar, coloque as lâminas num frasco Coplin de tampão PBS diluído até 5 minutos. 4. Adição de conjugado fluorescente: Agite para retirar o excesso de tampão PBS. Coloque novamente a lâmina na câmara húmida e cubra imediatamente cada poço com uma gota de conjugado fluorescente. Incube as lâminas por mais 30 ± 5 minutos. 5. Enxaguar as lâminas: Repita o passo Lamela: Os procedimentos das lamelas variam de laboratório para laboratório, no entanto, recomenda-se o seguinte: a. Coloque uma lamela numa toalha de papel. b. Aplique meio de montagem numa linha contínua até à extremidade inferior da lamela. c. Agite para retirar o excesso de tampão PBS e toque na extremidade inferior da lâmina até à extremidade da lâmina. Baixe suavemente a lâmina na lamela de forma a que o meio de montagem flua para a extremidade superior da lâmina sem formação nem retenção de bolhas de ar. Controlo de qualidade O Controlo positivo IgG F-Actina e controlo negativo do sistema IFA devem ser testados em cada lâmina para assegurar que todos os reagentes e procedimentos são actuam correctamente. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -70 o C. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, os resultados do teste devem ser considerados inválidos e o ensaio repetido. 1. O controlo positivo de anticorpos IgG F-Actina não diluído deve ser > O controlo negativo do sistema IFA tem de ser negativo. Interpretação dos resultados Reacção negativa: Uma amostra é considerada negativa se a coloração específica, de acordo com a descrita abaixo na secção Reacção positiva, for inferior ou igual ao controlo negativo do sistema IFA. As amostras podem apresentar vários graus de coloração específica ou de fundo de outros componentes celulares, mas serem negativas a anticorpos IgG anti- F-Actina. Reacção positiva: Uma amostra é considerada positiva se for observada uma coloração específica, numa concentração superior do que a do controlo negativo do sistema IFA, nas fibras de F-Actina rodeando a maior parte das células num padrão hexagonal e, por vezes, observada em fibras cruzando as células. Determine o grau de fluorescência ou intensidade utilizando os seguintes critérios: 4+ Fluorescência verde maçã brilhante 3+ Fluorescência verde maçã viva 2+ Fluorescência positiva manifestamente distinta 1+ Fluorescência específica mais baixa que permite que seja claramente distinguida uma coloração de F-Actina de um fundo fluorescente. Interpretação do padrão: Pode surgir uma variedade de padrões de coloração nuclear e/ou citoplásmica, dependendo dos tipos e quantidades relativas de auto-anticorpos presentes na amostra. Apenas o padrão descrito acima com o título reacção positiva deve ser considerado positivo a anticorpos IgG anti-f-actina. Todos os outros padrões devem ser considerados negativos. Limitações do método 1. O padrão de elevada titulação IgG anti-f-actina é sugestivo de AIH, mas não deve ser considerado como diagnóstico. O resultado IgG anti-f-actina deve ser considerado em combinação com outros testes laboratoriais, bem como com o historial clínico global do paciente. 2. Uma variedade de factores externos influencia a sensibilidade do teste, incluindo o tipo de microscópio de fluorescência utilizado, a potência e idade da lâmpada, ampliação utilizada, sistema de filtro e o observador. 3

4 3. Se for utilizado um filtro de passagem de banda em vez de um filtro de barreira de 515 nm, pode observar-se um aumento da coloração artifactual. 4. As lâminas só devem ser rotuladas utilizando um lápis. A utilização de qualquer outro material de escrita pode causar coloração artifactual. 5. Todos os frascos coplin utilizados para a lavagem das lâminas não devem ter qualquer resíduo de corante. A utilização de frascos coplin contendo resíduos de corante pode causar coloração artifactual. 6. As características de desempenho do ensaio foram estabelecidas para soro, mas não para plasma ou outros tipos de amostra. Valores esperados Foi avaliada a capacidade do teste Kit NOVA Lite TM IgG F-Actin para detectar anticorpos IgG F-Actina por comparação com o QUANTA Lite TM F-Actin IgG ELISA (INOVA Diagnostics, Inc) disponível no mercado. Os resultados ELISA foram considerados positivos se a amostra do doente foi igual ou superior a 20 unidades e negativa se inferior a 20 unidades. Intervalo de valores normais Foram testadas quatrocentas e noventa e três amostras de dadores de sangue utilizando o kit NOVA Lite TM IgG F-Actin. À excepção de 4 das 493 amostras (especificidade de 99,2%), todas foram negativas no NOVA Lite TM IgG F-Actin. Comparação entre NOVA Lite TM IgG F-Actin IFA e QUANTA Lite TM F-Actin IgG ELISA Para determinar a concordância de percentagem positiva e negativa dos testes, foram testadas 992 amostras contendo anticorpos de uma vasta gama de antigénios com o kit NOVA Lite TM IgG F-Actin IFA e o QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA. Estas amostras incluíram 493 dadores de sangue normais, 60 pacientes com doenças definidas clinicamente (artrite reumatóide, SLE e esclerodermia), 40 amostras com anticorpos definidos (doenças infecciosas e auto-anticorpos) e 399 amostras de pacientes com suspeita de ter doença hepática. N=992 QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA Positivo QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA Negativo Total NOVA Lite TM IgG F-Actin Positivo ** 290 NOVA Lite TM IgG F-Actin Negativo 69* Total Concordância positiva % 269/338 (80%) Concordância negativa % 633/654 (97%) Concordância global % 902/992 (91%) *39 das 69 foram ELISA fracamente positivas ** 14 das 21 foram 1+ IFA (baixa reactividade) 4

5 Referências 1. Chretien-Leprince P, Ballot E, Andre C, et al. Diagnostic value of anti-f-actin antibodies in a French multicenter study. Ann NY Acad Sci 1050: , Villalta D, Bizzaro N, Da Re M, et al. Diagnostic accuracy of four different immunological methods for the detection of anti-f-actin autoantibodies in type 1 autoimmune hepatitis and other liver related disorders. Autoimmunity 41: , Czaja A, Norman G: Autoantibodies in the diagnosis and management of liver disease. J Clin Gastroenterol 37: , Toh BH. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin exp Immunol 38: , Fusconi M, Cassani F, Zauli D, et al. Anti-actin antibodies: a new test for an old problem. Journal of Immunological Methods 130: 1-8, Granito A, Muratori L, Muratori P, et al. Antibodies to filamentous actin (F-actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Path 59: , Dighiero G, Lymberi P, Monot C. Sera with high levels of anti-smooth muscle and antimitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin exp Immunolol 82: 52-56, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (Domestic) : Technical Service (International) : info@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT February 2010 Revision 0 5