Antes de iniciar o procedimento, preparar o Tampão de Lise: adicionar 1 ml da solução MI2 ao tubo com Lisozima e agitar brevemente.

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1 Kit de Extração EliGene MTB Instruções de Uso USO PRETENDIDO O «Kit de Extração EliGene MTB» é destinado ao isolamento do DNA de espécies de Mycobacterium e eventualmente de outros organismos Gram positivos, de materiais clínicos como escarro, escarro descontaminado, culturas, lavado broncoalveolar, exsudados, urina e swabs. O kit é otimizado para uso com o «MTB Q-PCR Alert kit». PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO Muitos problemas como inibição, baixa sensibilidade entre outros, podem ocorrer quando se realiza o isolamento de DNA de Mycobacterium spp. O «Kit de Extração EliGene MTB» foi desenvolvido para evitar todos os problemas com os inibidores de PCR e pequenas quantidades de DNA. O tempo total do processo de isolamento é de cerca de 2 horas, incluindo duas incubações, cada uma de 30 minutos. O kit contém todos os componentes necessários para o isolamento de DNA, incluindo os microtubos. Não é necessária a adição de etanol ou outros produtos químicos. COMPONENTES Lisozima 5 x 1,4 x 10 6 um. Proteinase K (solução) 550 µl Solução MI1 100 ml Solução MI2 6 ml Solução MI3 11 ml Solução MI4 11 ml Solução MI5 27,5 ml Solução MI6 30 ml Solução MI7 11 ml Microtubos Spin Filtros 50 Tubos 2.0 ml 150 1

2 MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS - Micropipetas estéreis e ponteiras estéreis com filtro, livres de DNA, RNA, DNase e RNase. - Bloco de aquecimento ou banho-maria para C. - Centrífuga para microtubos (13000 x g). ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE Todos os componentes do kit devem ser transportados em temperatura ambiente. Após o recebimento, a Lisozima deve ser armazenada em -20 C até a diluição. A proteinase K (solução) deve ser armazenada em temperatura ambiente, ou a +4 C para períodos mais longos. Não congele novamente uma vez que houver descongelado a solução de proteinase. As soluções MI1, MI2 e as demais devem ser armazenadas em temperatura ambiente. As datas de validade encontram-se nas embalagens. PRECAUÇÕES Use luvas quando estiver manuseando o produto. No caso de isolamento de DNA MTB, é necessário trabalhar em uma capela de exaustão / fluxo laminar. Evite qualquer contato da pele com os reagentes do kit. No caso de contato, lave cuidadosamente com água. Não ingira. Os reagentes rotulados como inflamáveis devem ser mantidos afastados de chamas e fogo. Evite contato com alvejantes ou outros oxidantes. Este kit é usado para diagnóstico. PREPARO DE REAGENTES Antes de iniciar o procedimento, preparar o Tampão de Lise: adicionar 1 ml da solução MI2 ao tubo com Lisozima e agitar brevemente. Esta solução é estável por 14 dias a +4 C. PROCEDIMENTO Escarro, Lavado Bronco-alveolar, exsudatos e cultura de bactérias: Ressuspenda o escarro, exsudato ou bactéria da cultura no mesmo volume da solução MI1 (1:1) e centrifugue a x g por 10 minutos. No caso de amostras com alta viscosidade, adicionar a solução MI1. Aspirar o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 µl do tampão de lise (solução MI2 com lisozima) Incube por 30 minutos a 37 C. 2

3 Urina, escarro descontaminado e lavado bronco-alveolar: Centrifugue a urina, escarro descontaminado e o lavado broncoalveolar a x g por 10 minutos e ressuspenda o pellet em 100µl do tampão de lise (solução MI2 com lisozima) Incube por 30 minutos a 37 C. Swab Coloque o swab no microtubo com pelo menos 2mL da solução MI1 e homogeneíze com vortex em velocidade alta por 2 minutos. Descarte o swab e centrifugue a x g por 10 minutos. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100µl do tampão de lise (solução MI 2 com lisozima) Incube por 30 minutos a 37 C. Adicione 100µl do tampão MI3 com 10 µl de proteinase K. Adicionar 20 µl do controle interno ao lisado. Homogeneíze em vortex e incube por 30 minutos a 65 C. Ao final da incubação a 65 C aumente a temperatura a 95 C e incube a mistura por mais 10 minutos a 95 C. Logo após homogeneíze a amostra em vortex na velocidade máxima por 1 minuto e dar um pulso para remover gotas da tampa. Deixe a amostra em repouso por 5 minutos para diminuir a temperatura do lisado à temperatura ambiente. Adicione 200 µl da solução MI4 e homogeneíze em vortex por 15 segundos. Centrifugue brevemente para remover qualquer gota do topo da tampa. Transfira toda a mistura para o filtro spin. Centrifugue por 1 minuto a x g. Transfira o tubo spin para um novo tubo. Adicione 500 µl da solução MI5 no filtro spin. Centrifugue por 30 segundos a x g. Remova o filtro spin, descarte o fluido e recoloque o filtro spin. Adicione 500 µl da solução MI6 no filtro spin. Centrifugue por 30 segundos a x g. Remova o filtro spin, descarte o fluido, recoloque o filtro spin. Centrifugue novamente por 30 segundos a x g. Cuidadosamente, remova o filtro spin e transfira para um novo tubo sem entrar em contato com o lavado. Adicione 50µl da solução MI7 pré-aquecida em alíquotas a 65 C. Incube por 5 minutos. Centrifugue por 1 minuto a x g. Remova o tubo spin e feche a tampa do tubo. O DNA genômico no tubo está pronto para uso em qualquer aplicação. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Todo o processo de isolamento de DNA deve ser realizado com controle interno. O controle interno irá fornecer as informações sobre a suscetibilidade do isolamento de DNA e sobre os possíveis inibidores de PCR. No caso de amostra com inibição melhor é usar amostras de DNA preparadas por um novo isolamento de DNA. 3

4 ALERTA: A contaminação no espaço do laboratório também é possível. Use pipetas separadas para misturas, para os controles positivos e para as amostras. Siga todas as recomendações para laboratórios de análise de DNA. CARACTERÍSTICAS FUNCIONAIS Dentro da estrutura de testes das características funcionais do «Kit de Extração EliGene MTB», 559 espécimes clínicos foram analisados. Destes espécimes foram analisados 518 testes cegos da região de Praga e 41 espécimes MTB positivos verificados por cultivo da região Brno. Destas 559 amostras clínicas 52 amostras foram MTB positivas por outros métodos laboratoriais (microscópio, cultivo, MGIT). O «Kit de Extração EliGene MTB» isolou com sucesso DNA MTB de todos os espécimes clínicos MTB positivos. 26 espécimes foram inibidos durante a PCR estas amostras foram identificadas por outros métodos como negativas. A sensibilidade e a efetividade do isolamento de DNA MTB realizada pelo «Kit de Extração EliGene MTB»: O kit de isolamento mostrou 100% de sensibilidade no isolamento do DNA de material clínico descontaminado o que significa que este procedimento para isolamento de DNA MTB fornece uma quantidade de DNA MTB 100% suficiente para o método diagnostico de DNA seguinte. A efetividade destes procedimentos de isolamento é de 95,34%, o que significa que da quantidade total de espécimes isolados foram isolados 95,34% dos espécimes sem inibição. Um resultado negativo obtido com este produto sugere que o DNA MTB não foi detectado no DNA extraído da amostra, mas também pode indicar que contém DNA MTB em uma titulação menor que o limite de detecção do produto; neste caso o resultado seria um falso negativo. O controle interno deve ser usado durante o isolamento do DNA MTB para evitando-se a liberação de resultados falso negativos causados por inibidores de PCR. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO O kit deve ser usado somente com as seguintes amostras clínicas humanas: escarro, escarro descontaminado, Lavado Bronco-alveolar, exsudatos, urina. Culturas bacterianas também podem ser usadas. Este kit não deve ser usado para o isolamento de DNA MTB do sangue. Os resultados obtidos com este produto estão sujeitos a correta coleta, transporte, armazenamento e preparação das amostras. Para evitar erros nos resultados é necessário tomar particular cuidado durante estas fases e seguir cuidadosamente as instruções fornecidas. Este produto deve ser manuseado por pessoal treinado em técnicas de biologia molecular, como extração, amplificação e detecção de ácidos nucléicos, para evitar erros nos resultados. É necessário haver áreas separadas para a extração/preparação de reações de amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos para prevenir resultados falso positivos. 4

5 Este produto exige o uso de vestimenta especial e instrumentos para a extração/preparação das reações de amplificação e para amplificação/detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falso positivos. Como em qualquer material diagnóstico, os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando-se todos os dados clínicos e outros testes laboratoriais feitos no paciente. Como em qualquer material diagnostico, existe um risco residual de obter resultados inválidos, falso positivos e falso negativos. Este risco residual não pode ser eliminado ou reduzido. Em situações particulares como diagnósticos emergenciais, este risco residual pode contribuir para decisões incorretas com conseqüências potencialmente graves para o paciente. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES Este produto é exclusivamente para uso in vitro. Advertências e precauções gerais Manuseie e descarte todas as amostras biológicas como potencialmente infecciosas. Evite o contato direto com amostras biológicas. Evite respingos. Os materiais que entram em contato com amostras biológicas devem ser tratados com hipoclorito de sódio 3% por, no mínimo, 30 minutos, ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados. Manuseie e descarte todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos. Evite contato direto com reagentes. Evite respingos. Os resíduos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de segurança. Resíduos líquidos contendo ácidos ou bases devem ser neutralizados antes do descarte. Use jaleco, luvas e óculos de proteção. Nunca pipete soluções com a boca. Não coma, beba, fume ou aplique cosméticos dentro da área de trabalho. Lave as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes. Descarte as sobras de reagentes e resíduos de acordo com as normas de segurança. Leia as instruções de uso antes de utilizar o produto. Siga as instruções. Não use produtos após o prazo de validade estabelecido. Somente use os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes de outros fabricantes. Advertências e precauções de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extração, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal especializado para prevenir o risco de resultados incorretos, em particular devido à degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou devido à contaminação das amostras por produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extração/preparação das 5

6 reações de amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de amplificação (áreas de pré e pós-pcr). Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extração/preparação das reações de amplificação. É necessário uso de EPI adequado a cada uma das áreas de trabalho em laboratório de biologia molecular. Nunca transfira materiais da área de amplificação/detecção para a área de extração/preparação de reações. As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas em uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contêm amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou serem usadas com ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados em câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma única vez. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este propósito. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para sua área de trabalho. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BANNISTER Barbara A., BEGG Norman T., GILLESPIE Stephen H.: Infectious Disease. Blackwell Science, 2th Ed., 2000 IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, Curitiba PR - CEP: Tel.: (41) Fax: (41) DDG: Website: CNPJ: /

7 INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. C.so Torino, 89/d Buttigliera Alta (TO) - Itália REGISTRO ANVISA RESPONSÁVEL TÉCNICA Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR: Aprovação: 24/12/2013 X Maurício Cichon Laboratório Assinado por: Maurício Cichon 7

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