Anticorpo Monoclonal Conjugado de Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) HLA-B27 Número de catálogo B27F50X (10

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1 Anticorpo Monoclonal Conjugado de Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) HLA-B27 Número de catálogo B27F50X (10 µl/teste) Para Uso Diagnóstico In Vitro. FIM A QUE SE DESTINA Um procedimento qualitativo, com sangue total, para coloração por imunofluorescência directa dos antigénios de superfície HLA-B27 com análise por citometria de fluxo. RESUMO E EXPLICAÇÃO O anticorpo monoclonal conjugado de FITC HLA-B27 reage especificamente com o antigénio B27 do leucócito humano. Este reagente deve ser utilizado na imuno-coloração de linfócitos humanos no sangue total. A intensidade da fluorescência dos linfócitos pode ser analisada num citómetro de fluxo depois de os eritrócitos serem lisados e separados. Descobriu-se que o HLA B27 está altamente associado à espondilite ancilosante. Os testes da presença do antigénio HLA- B27 num doente são utilizados para confirmar o diagnóstico da espondilite ancilosante. PRINCÍPIO O anticorpo monoclonal conjugado de FITC HLA-B27 detecta as células que transportam o antigénio B27 nas suas membranas. O sangue total é, primeiramente, corado com o anticorpo monoclonal conjugado de FITC HLA-B27, seguida da lise dos glóbulos vermelhos e da fixação dos glóbulos brancos com formaldeído. A análise por citometria de fluxo é então realizada nos glóbulos brancos após a remoção dos detritos. REAGENTES A. Identificação 1. Especificidade: HLA-B27 2. Clone: O FD705-9E1E10 é derivado da hibridação das células de mieloma P3X63Ag8.653 do ratinho com as células do baço de ratinho CB6F1 imunizado com a linha celular humana positiva de HLA-B27. 2 O anticorpo é purificado dos fluidos da ascite por meio de cromatografia de afinidade da proteína G. 3. Composição da cadeia Ig: Cadeia pesada IgG2b e cadeia leve kappa do ratinho. B. Advertência ou precaução 1. Para Utilização em Diagnóstico In Vitro. 2. Aviso: Todos os produtos derivados do sangue deverão ser tratados como potencialmente infecciosos. Constatou-se que o material de origem do qual deriva este produto é negativo quando testado em conformidade com os testes actualmente exigidos pela FDA. Nenhum método de teste conhecido pode oferecer garantias de que os produtos derivados do sangue humano não transmitem agentes infecciosos. 3. Aviso: Este reagente contém 0,1% de azida sódica que, mediante condições acídicas, produz ácido hidrazónico, um composto extremamente tóxico. Os reagentes que contêm azida sódica devem ser diluídos em água corrente antes de serem eliminados. São recomendadas estas condições para evitar depósitos nas canalizações onde se podem

2 desenvolver condições explosivas. 4. Aviso: O formaldeído é tóxico e alergénico e é potencialmente cancerígeno. Na Califórnia, o formaldeído aparece na lista dos produtos cancerígenos. Evitar o contacto com os olhos, a pele e o vestuário. 5. Advertência: Não utilizar o reagente caso se observe precipitado. 6. Consultar a folha de dados de segurança do material para obter informações detalhadas. C. Instruções de utilização Consultar Instruções de Utilização. D. Instruções de armazenamento Armazenar no escuro entre 2 e 5 C. Utilizar antes do fim da data de validade impressa na embalagem. Page 2 Página 2 de 5 E. Indicações de instabilidade Não utilizar caso se observe precipitado. REQUISITOS DO INSTRUMENTO FACScan ou equivalente. COLHEITA E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS A amostra de sangue deve ser colhida num tubo de colheita de sangue EDTA (K3) Vacutainer e deve ser analisada, no máximo, ao fim de três dias. No entanto, também se pode utilizar ACD e heparina sódica. PROCEDIMENTO A. Materiais fornecidos Anticorpo monoclonal conjugado de FITC HLA-B27. B. Materiais necessários mas não fornecidos Solução de Lise da Marca FACS Concentrada 10X (Becton Dickinson, número de encomenda ou equivalente). Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Irvine Scientific, número de catálogo 9242 ou equivalente). Solução fixante: PBS com formaldeído a 0,5%; adicionar 1,35 ml de 37% de formaldeído a 100 ml de PBS. Controlo negativo: Anticorpo monoclonal de ratinho IgG2b conjugado de FITC. (Número de catálogo OLI TIS250U) Controlo positivo: Anticorpo monoclonal conjugado de FITC HLA da Classe I. (Número de catálogo OLI HLA1F50X) C. Procedimento passo-a-passo. Consultar INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO na caixa em cima. INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO 1. Para evitar perdas de volume, antes de abrir, centrifugue o frasco durante alguns segundos numa microcentrífuga (o líquido pode acumular-se na tampa durante o transporte). 2. Pipete 100 µl da amostra de sangue total para um tubo de 12 x 75 mm. 3. Pipete 10

3 µl de anticorpo monoclonal conjugado de FITC HLA-B27 para dentro do tubo e misture bem, suavemente, num misturador vortex. 4. Incube o tubo no escuro durante 15 minutos a uma temperatura entre 2 e 5 C com uma rotação suave. 5. Dilua 10X solução de lise numa proporção de 1:10 com água destilada. Adicione ao tubo 3 ml de 1X tampão de lise. 6. Submeta ao agitador vortex e incube o tubo no escuro à temperatura ambiente durante 10 minutos. 7. Centrifugue o tubo a 300 g durante 5 minutos. 8. Aspire o sobrenadante. 9. Re-suspenda o concentrado em 2 ml de PBS e submeta o tubo ao agitador vortex. 10. Centrifugue o tubo a 300 g durante 5 minutos. 11. Aspire o sobrenadante. 12. Re-suspenda o concentrado em 0,5 ml de solução fixante. As células estão prontas para análise imediata no citómetro de fluxo ou podem ser armazenadas no escuro entre 2 e 5 C por um máximo de 24 antes de serem analisadas. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO A. O EDTA é o anticoagulante de eleição. No entanto, também pode utilizar ACD e heparina sódica. B. As amostras de sangue estéreis devem ser armazenadas à temperatura ambiente e devem ser analisadas, no máximo, ao fim de 3 dias após a colheita. C. O volume recomendado de reagente baseia-se em estudos de sangue humano normal. D. Os laboratórios que utilizam procedimentos e/ou instrumentos diferentes dos recomendados acima podem necessitar de ajustar o volume de reagente necessário para cada amostra para obter os melhores resultados. RECOLHA DE DADOS A. Alinhe e realize controlos de qualidade diários ao citómetro de fluxo, de acordo com os procedimentos de arranque recomendados pelo fabricante. Page 3 Página 3 de 5 B. Se estiver a utilizar o citómetro pela primeira vez, deve testar pelo menos 5 amostras conhecidas positivas para HLA-B27 e 10 amostras conhecidas negativas para HLA-B27 no citómetro de fluxo para estabelecer o intervalo do canal de pico seleccionado e do canal médio para B27 no que se refere aos fenótipos positivos e negativos. C. Os controlos positivos e negativos para HLA-B27 devem ser processados diariamente antes de se realizar a análise da amostra. Se os controlos não se encontrarem dentro do intervalo, realinhe e realize um controlo de qualidade (CQ) ao citómetro de fluxo. O controlo positivo conhecido pode ser proveniente da amostra fresca de um dador ou de uma alíquota de um grupo de linfócitos criopreservados, que são descongelados e corados juntamente com as amostras de

4 teste. Aconselha-se um CQ mais frequente quando se analisam grandes quantidades de amostras. Recomendamos que ajuste a fluorescência das populações negativas de forma a que fiquem entre os canais 10 e 20. D. Recolha uma fluorescência verde de a eventos para cada amostra. E. Seleccione a região de linfócitos e obtenha o canal de pico e médio (Fig. 1, 2 e 3). F. Atribua o fenótipo HLA-B27 com base nos critérios estabelecidos. VALORES ESPERADOS A. As amostras positivas para HLA-B27 terão um canal médio seleccionado de >70 e as amostras negativas para HLA-B27 terão um canal médio seleccionado de <40, com base num estudo realizado nos nossos laboratórios utilizando um citómetro de fluxo da marca FACS. Os valores esperados podem variar, dependendo das condições de teste de cada laboratório e da calibração do citómetro de fluxo. Cada laboratório deve estabelecer os intervalos normais para as células positivas para HLA-B27 e para as células negativas para HLA-B27, de acordo com as suas próprias condições de teste para cada lote de amostras. B. A maioria das amostras utilizadas para obter os valores de canal médio seleccionado foram obtidas de dadores caucasianos. O intervalo dos valores pode ser diferente para as amostras de outras raças. C. A maioria dos sub-tipos B27 (B27-01, 02, 03, 04, 05, 06, 07 e 09) testados apresentaram reacções positivas; no entanto, o B2708 apresentou reacções negativas. Ao contrário da maioria dos sub-tipos B27, que serologicamente se comportam como o Bw4, o sub-tipo B2708 está associado ao Bw6. D. Determinadas amostras com B44, B57 podem gerar fundos mais elevados. Por isso, devem ser incluídas algumas amostras com esses tipos para o estabelecimento inicial dos intervalos positivos e negativos. E. Os lotes individuais do B27 FITC podem apresentar deslocações de canal médio diferentes. Por isso, o valor de cut-off positivo/negativo poderá ter que ser ajustado de acordo com o desempenho de cada lote individual. BIBLIOGRAFIA 1. HLA and Disease Associations, Eds. Tiwari, JL and Terasaki, PI. Springer-Verlag, New York, Pei, R, et al. A monospecific HLA-B27 fluorescein isothiocyanate-conjugated monoclonal antibody for rapid, simple and accurate HLA-B27 typing. Tissue Antigens, 41: , NCCLS Tentative Standard. Leukocyte Differential Counting. Publication Number H20-T, NCCLS Vol. 4, No. 11, Ward, AM and Nikaein, A. Comparison of monoclonal antibodies for flow cytometric analysis of HLA-B27 antigen. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 22:65-69, ABREVIATURAS UTILIZADAS NESTE DOCUMENTO ACD Dextrose de ácido citrato CV Coeficiente de variação EDTA Ácido tetracético de etilenodiamina FITC Isotiocianato de fluoresceína FSC

5 Difusão para a frente HLA Antigénio do leucócito humano PkChl Canal de pico SD Desvio padrão SSC Difusão lateral MARCAS COMERCIAIS USADAS NESTE DOCUMENTO FACS Marca registada da Becton-Dickinson. Vacutainer Marca registada da Becton-Dickinson. REPRESENTANTE EUROPEU AUTORIZADO MDSS GMbH, Burckhardstrasse 1, D-30163, Hannover, Germany, Página 4 de 5 HISTOGRAMAS DE REFERÊNCIA E DIAGRAMAS DE PONTOS B27+ and B27 - Histograma de amostras (seleccionadas) Figura 1. O diagrama de pontos (FSC vs. SSC) representa o sangue total lisado (linfócitos seleccionados). Figura 2. Histograma FL-1 e estatísticas (seleccionados) da amostra B27+. Figura 3. Histograma FL-1 e estatísticas (seleccionados) da amostra B27-. Diagramas de pontos de amostras para sangue lisado e não lisado Figura 4a: Sangue lisado. Figura 4b: Sangue não lisado. Figura 4c: Sangue parcialmente lisado. Figura 5. Histograma FL-1 e estatísticas (seleccionados) da amostra B27+ parcialmente lisada. Page 4 Página 5 de 5 RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS Problema Causa Solução 1. Padrão de diagrama de pontos anormal a. Os parâmetros FACS não estão correctamente definidos. b. O sangue total não foi bem lisado. a. Certificar-se de que as definições dos parâmetros FACS estão correctas. Isto pode realizar-se utilizando qualquer amostra de Page 5

6 sangue total fresco. b. Verificar o tampão de lise e as condições da lise. Se tiverem sido utilizados o tampão de lise e as condições correctas: Pegar na amostra não lisada, diminuir a velocidade de rotação das células e repetir o procedimento de lise. Aumentar a quantidade de tampão de lise para 4 ml. Aumentar a temperatura de incubação da lise para 37 C. Aumentar o tempo de incubação da lise para 20 minutos. 2. Sinal fraco das amostras positivas para B27 a. O citómetro de fluxo precisa de ser alinhado. b. O sangue total pode não ter sido bem lisado. c. O sangue não ficou bem misturado com o anticorpo. a. Realinhar o instrumento. b. Verificar o diagrama de pontos da amostra. Se o seu aspecto não for normal ou se o histograma apresentar dois picos, lisar novamente a amostra. Consultar o ponto 1.b acima nesta tabela. c. Certificar-se de que o sangue ficou bem misturado com o anticorpo. 3. Fundo alto das amostras positivas para B27. a. O sangue total pode não ter sido bem lisado. b. A incubação do anticorpo pode ser superior a 15 minutos. c. A concentração de anticorpo FITC pode ser superior à recomendada. d. Foi utilizada uma quantidade de anticorpos superior a quantidade recomendada. a. Consultar a solução 1b, em cima. b. Incubar durante 15 minutos. c. Verificar a concentração de anticorpo FITC. d. Verificar a quantidade de anticorpo

7 utilizada.