5 Preparação da suspensão de linfócitos:

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1 1 Introdução: Tabuleiros de classificação de HLA Instruções de utilização Para ser utilizado em procedimentos de diagnóstico in vitro Os tabuleiros de classificação de HLA da Invitrogen são produzidos para a identificação e definição de antígenos de histocompatibilidade e destinam-se a ser utilizados na classificação de HLA. O ensaio de microlinfocitotoxicidade utiliza linfócitos como alvo. As células viáveis são facilmente extraídas do sangue periférico, nódulos linfáticos, baço, etc. Este ensaio serológico mede a mortalidade celular através da activação de complemento (coelho) na presença de combinações de antígenos-anticorpos específicos. A reacção do complemento antígeno-anticorpo é medida através da visualização do teste em microscópio com uma ampliação de 150 vezes, com iluminação de contraste de fases e uma mancha vital, como Eosina Y ou Iodeto de Propídio. As células mortas (que possuem o antígeno detectado pelo antisoro específico) irão absorver o contraste e apresentarão uma mudança de cor apropriada. As células negativas (aquelas que não possuem o antígeno detectado pelo antisoro específico) permanecem viáveis e excluem o contraste. Os tabuleiros de classificação de HLA da Invitrogen destinam-se a ser utilizados no ensaio de microlinfocitotoxicidade para a definição de antígenos HLA. Antisoros operacionalmente mono-específicos e multi-específicos para os antígenos de HLA estão incluídos. Controlos positivos e negativos estão incluídos no conjunto de tabuleiros. ATENÇÃO: MANUSEAR COMO POTENCIAL AGENTE TRANSMISSOR DE DOENÇAS INFECCIOSAS O plasma e/ou o soro a partir do qual este produto foi derivado foi testado e considerado como negativo para a presença de HBsAg, HIV-1 e HCV através de um método de ensaio aprovado pela FDA. Contudo, nenhum método de teste oferece uma garantia completa da ausência de HIV, vírus da hepatite B ou outros agentes infecciosos. Portanto, as amostras devem ser manuseadas como amostras de sangue humano potencialmente infecciosas. 2 Componentes do kit: 2.1 Tabuleiros com 72 reservatórios contendo 1 μl/reservatório de antisoros com 0,1% de azida sódica como conservante e vermelho de fenol como indicador de ph, revestidos com 4-5 μl de óleo mineral. Conservar a 55 C num FRIGORÍFICO VENTILADO (sem formação de gelo). 2.2 Complemento de coelho, 3 ml vial(s). Conservar a 55 C num FRIGORÍFICO VENTILADO (sem formação de gelo). 2.3 Ficha técnica / certificado de análise 3 Material, reagentes e equipamento não fornecidos: 3.1 Centrifugador de bancada 3.2 Microscópio luminoso 3.3 Microscópio de contraste de fase invertida ou fluorescente invertido 3.4 Pipetas Pasteur com 15 e 23 cm 3.5 Seringas de microtitulação com 50 μl, 100 μl, 250 μl de capacidade 3.6 Provetas com 12 x 75 mm e 17 x 100 mm 3.7 Hemacitómetro 3.8 Lamela de cobertura em vidro com 5 x 7,5 cm 3.9 Partículas magnéticas, Invitrogen Dynabeads HLA Cell Prep I (código de produto USA, 21002D-Todos os outros) e Invitrogen Dynabeads HLA Cell Prep II (código de produto USA, Todos os outros ) 3.10 Dextrano a 5% 3.11 Solução Ficoll-Hypaque 3.12 Meio RPMI-1640 com tampão de HEPES e Pen/Strep acrescentados 3.13 Solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) 3.14 Corante Trypan Blue 3.15 Solução de eosina Y ou CFDA 3.16 Formalina neutralizada a 12-37% com ph de 7,0±0,2 ou iodeto de propídio em solução de têmpera 3.17 Soro humano agrupado (PHS), código de produto da Invitrogen n.º Requisitos da amostra: 4.1 Uma suspensão de linfócitos é preparada a partir de 10 ml de sangue total colhido num tubo de ensaio em vácuo com solução heparinizada, ACD ou de citrato de sódio. A concentração celular é ajustada para 2-3 x 10 6 células/ml. A

2 suspensão de linfócitos tem de ser preparada no prazo de 48 horas após a colheita do sangue total de modo a garantir a máxima viabilidade. A suspensão deve ser conservada à temperatura ambiente até ser utilizada. 4.2 Uma viabilidade superior a 80% sem contaminação excessiva de células não linfócitas é essencial para o melhor rendimento de soros de classificação de leucócitos. 4.3 A contaminação por granulócitos ou um fundo elevado de linfócitos não viáveis poderá resultar numa reacção de falsopositivo. 4.4 A contaminação por plaquetas pode resultar numa lise incompleta de linfócitos, provocando uma reacção de falsonegativo. 4.5 Os linfócitos podem ser preparados de acordo com o procedimento que se segue ou segundo métodos adicionais que se encontram enumerados no manual ASHI de procedimentos laboratoriais. 5 Preparação da suspensão de linfócitos: 5.1 Colher 10 ml de sangue total num tubo de ensaio em vácuo com solução heparinizada, ACD ou de citrato de sódio. (O EDTA foi considerado como um anticoagulante inaceitável.) Armazenar a amostra à temperatura ambiente até ser utilizada. 5.2 Centrifugar o sangue durante 10 minutos a x g para obter uma crosta inflamatória Isto também pode ser efectuado utilizando um agente agregante, como dextrano a 5%, do seguinte modo: Misturar 2 ml de dextrano a 5% com 10 ml de sangue total e permitir a sedimentação dos glóbulos vermelhos a uma temperatura de 37 C durante 15 minutos. 5.3 Utilizando uma pipeta Pasteur, retirar cuidadosamente a crosta inflamatória (aproximadamente 2 ml) e transferi-la para um tubo de ensaio limpo com 17 x 100 mm contendo 5 ml de HBSS. Misturar bem. 5.4 Distribuir 4 ml de solução gradiente Ficoll-Hypaque (FH) (a 22 C) num tubo de ensaio limpo com 17 x 100 mm. Colocar cuidadosamente a suspensão de crosta inflamatória sobre a solução gradiente FH. 5.5 Centrifugar durante 20 minutos a 700 x g. Após a centrifugação, as células mononucleares podem ser observadas como uma faixa estreita na interface entre o plasma/diluente e a solução gradiente. 5.6 Aspirar toda a camada de células mononucleares e transferi-la para um tubo de ensaio com 17 x 100 mm. Diluir com 4 ml de HBSS. 5.7 Centrifugar durante 10 minutos a 600 x g. Remover o sobrenadante, voltar a suspender cuidadosamente o agregado celular, acrescentar 4 ml de HBSS e centrifugar durante 10 minutos a 600 x g. 5.8 Retirar o sobrenadante e voltar a suspender o agregado celular em 1 ml de RPMI-1640 com 20% de PHS. 5.9 Examinar a suspensão celular num hemacitómetro. Avaliar a pureza e efectuar uma contagem de células. Ajustar a concentração celular para 2-3 x 10 6 células/ml Realizar um teste de viabilidade de acordo com as instruções que se seguem Acrescentar uma gota de corante Trypan Blue e uma gota de suspensão celular num tubo de ensaio limpo e, em seguida, misturar bem Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 15 min Examine a viabilidade das células em um hemocitômetro. As células viáveis possuem membranas celulares intactas e aparecem lisas; são capazes de excluir o Azul Tripan e consequentemente não serão coradas. As células não viáveis não possuem membranas celulares intactas e portanto não aparecem lisas, são incapazes de excluir o Azul Tripan e consequentemente serão coradas As suspensões de linfócitos são prontas para uso no Teste de Microlinfocitotoxicidade Classe I usando o método de exclusão por coloração. 6 Separação de células B e T: 6.1 Através de lã de nylon: Os linfócitos B e T são facilmente separados através da utilização da técnica de lã de nylon. As células B e os macrófagos apresentam o atributo de aderirem a lã de nylon, enquanto que as células T não o fazem. Consultar a 4. a edição do manual ASHI de procedimentos laboratoriais; parágrafo 1.A.6 Separação de linfócitos T e B através de lã de nylon para conhecer o processo de separação de células B e T. 6.2 Através de partículas: É possível adquirir partículas magnéticas junto de vários fabricantes As soluções HLA Cell Prep I e HLA Cell Prep II (Invitrogen ) foram testadas para utilização com todos os tabuleiros de Classe I e II. Consultar as instruções de utilização do fabricante As células B e T purificadas por partículas são geralmente pré-contrastadas utilizando CFDA (diacetato de carboxifluoresceína) ou brometo de etídio.

3 7 Teste de microlinfocitotoxicidade: 7.1 Preparar uma suspensão de linfócitos com uma viabilidade mínima de 80%, sem contaminação excessiva por células não linfócitas. 7.2 Retirar os tabuleiros de classificação de HLA da Invitrogen do frigorífico, descongelar e deixar os tabuleiros atingirem a temperatura ambiente para a realização de testes imediatos. Voltar a colocar os restantes tabuleiros congelados num frigorífico ventilado (sem formação de gelo) a uma temperatura de 55 C ou inferior Os tabuleiros embalados abertos devem ser utilizados imediatamente ou armazenados durante um período máximo de um mês a 55 C ou a uma temperatura inferior. 7.3 Utilizando uma seringa de 50 µl, acrescentar 1 µl de suspensão de linfócitos (aproximadamente linfócitos) à parte superior de cada reservatório de teste, tendo o devido cuidado de não tocar nos antisoros. Examinar cada reservatório para garantir a mistura da suspensão de linfócitos e do antisoro. 7.4 Incubar os tabuleiros à temperatura ambiente (22 C ± 3 C). Classe I (exclusão por contraste) Classe I (fluorescência) Classe II (fluorescência) 30 min. 30 min. 45 min. 7.5 Utilizando uma seringa de 250 µl, acrescentar 5 µl do complemento de coelho fornecido com a embalagem de tabuleiros aos reservatórios de teste, tendo o cuidado de não tocar na mistura de antisoros/linfócitos com as pontas da seringa. Nota: Os tabuleiros de classificação foram optimizados para o lote de complemento incluido no kit. A utilização de um complemento diferente pode resultar em reacções fracas ou em falsos positivos. 7.6 Incubar os tabuleiros à temperatura ambiente (22 C ± 3 C). Classe I (exclusão por contraste) 60 min. Classe I (fluorescência) 50 min. Classe II (fluorescência) 60 min. 7.7 Utilizando uma seringa de 100 µl ou equivalente, acrescentar 2 µl de eosina Y aquosa a 5% filtrada a cada reservatório de teste e incubar à temperatura ambiente (22 C ± 3 C) durante 3-5 minutos. Ter o cuidado de não tocar na mistura de antisoro/linfócitos com as pontas das seringas. Omitir esta etapa caso esteja a ser utilizado um ensaio à base de fluoresceína. 7.8 Utilizando uma seringa de 250 µl, acrescentar 5 µl de formalina neutralizada filtrada a cada reservatório de teste, tendo o cuidado de não tocar na mistura de antisoros/linfócitos. Omitir esta etapa nos ensaios à base de fluoresceína Ensaios baseados em fluoresceína: Acrescentar 5 µl de iodeto de propídio em solução de têmpera a cada um dos reservatórios de teste, tendo o cuidado de não tocar na mistura de antisoros/linfócitos. 7.9 Colocar uma lamela de cobertura sobre o tabuleiro e deixar as chapas repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir que os linfócitos assentem Os tabuleiros marcados com eosina Y podem ser lidos após uma hora ou no dia seguinte Os tabuleiros marcados com fluoresceína podem ser lidos após 30 minutos ou no dia seguinte. Nota: A leitura de um tabuleiro marcado com fluoresceína após 36 horas pode resultar num resultado falso positivo acrescido Realizar a leitura do teste ao microscópio com uma ampliação de 150 X debaixo de iluminação de constrate de fases. 8 Resultados: 8.1 As células mortas (aquelas que possuem o antígeno) absorvem o contraste, apresentam-se aumentadas e escurecidas e demonstram pormenores nucleares nítidos. As células viáveis (aquelas que não possuem o antígeno) excluem o contraste e apresentam-se ligeiramente mais brilhantes e mais pequenas, em comparação com as células mortas. 8.2 Em alternativa, as células viáveis marcadas por fluorescência apresentam-se em cor verde e as células não viáveis apresentam-se em cor vermelha. 8.3 Após correcção para a percentagem de células mortas em reservatórios de controlo negativo, o teste é classificado da seguinte forma: % de células Classificação Interpretação mortas Negativo Negativo duvidoso Fraco positivo Positivo Forte positivo -- 0 Ilegível 9 Normas de desempenho:

4 9.1 Especificidade e sensibilidade Os tabuleiros de classificação de HLA da Invitrogen foram exaustivamente testados por ensaios internos e externos contra um painel de linfócitos devidamente qualificado contendo vários grupos étnicos. As diluições e a especificidade de cada soro de classificação de HLA da Invitrogen no conjunto de tabuleiros foram determinadas por titulação (utilizando diluições sucessivas) contra suspensões de linfócitos com tipos conhecidos de HLA. Cada soro é utilizado na respectiva diluição óptima para obter o valor de reacção mais elevado, mantendo simultaneamente a especificidade. A maioria dos soros apresentam valores R de 0,8 ou superiores. As informações contidas no Certificado de Análise fornecido para cada lote de tabuleiros ajudará a explicar reacções inesperadas O soro de controlo positivo de HLA da Invitrogen (soro de linfócitos anti-humanos de coelho) está incluído em cada tabuleiro O soro humano agrupado (PHS) da Invitrogen é utilizado como soro de controlo negativo em cada tabuleiro. Este soro foi analisado e considerado como negativo para a presença de anticorpos linfocitotóxicos contra células T e B através dos ensaios microlinfocitotóxicos normalizados. 10 Resolução de problemas: 10.1 Um fundo elevado ou falsos positivos podem dever-se a: A amostra apresenta uma baixa viabilidade celular ou células danificadas. Retirar as células mortas antes de acrescentar aos tabuleiros de classificação ou preparar outra suspensão celular A amostra está contaminada por granulócitos ou outros não linfócitos. Retirar as células não linfócitas antes de acrescentar aos tabuleiros ou preparar outra suspensão celular Os reagentes que contêm substâncias tóxicas ou que apresentam um ph fora da amplitude fisiológica normal podem causar danos celulares. Certificar-se de que os reagentes utilizados foram devidamente testados O complemento é demasiado forte ou apresenta um elevado nível de toxicidade. Utilizar o lote de complemento incluido no kit O tempo de incubação é demasiado longo. Certificar-se de que estas instruções de utilização são rigorosamente observadas quanto ao tempo de incubação com base em técnicas de isolamento de células Uma reacção incompleta ou de falsos-positivos pode ser causada por transição de células ou de soro Uma reacção débil ou falsos negativos podem dever-se a: A amostra está demasiado concentrada. Certificar-se de que a concentração celular é ajustada para 2-3 x 10 6 células/ml A amostra está contaminada por plaquetas Os reagentes apresentam um ph alterado devido a exposição a CO 2 ou contaminação por bactérias. Utilizar reagentes novos e verificar o ph antes da utilização O complemento é demasiado fraco ou foi inactivado antes do acrescento aos tabuleiros. Utilizar o lote de complemento incluido no kit A temperatura de incubação é inadequada. Temperaturas baixas provocam uma reacção mais lenta, enquanto que temperaturas altas provocam degradação dos componentes capsulares. Certificar-se de que a temperatura de incubação é de 22 C ± 3 C O tempo de incubação é demasiado curto. Certificar-se de que estas instruções de utilização são rigorosamente observadas quanto ao tempo de incubação com base em técnicas de isolamento de células. 11 Limitações e precauções: 11.1 O complemento de coelho é um reagente crítico no procedimento de teste de linfocitotoxicidade e pode variar entre lotes. Um complemento não satisfatório resultará em reacções fracas ou de falsos-negativos ou num fundo elevado no controlo negativo. A actividade do complemento de coelho pode ser determinada através de teste com controlos positivos e negativos apropriados, bem como através de linfócitos e antisoros conhecidos A Invitrogen Corporation recomenda a utilização de complemento do lote específico incluido no kit O HLA-ABC e o complemento DR da Invitrogen foram controlados individualmente em termos de qualidade para satisfazer valores mínimos de título e de toxicidade de fundo (consultar o catálogo e/ou o folheto informativo incluído da embalagem do complemento). Contudo, é aconselhável que as amostras de cada lote novo de complemento sejam testadas em paralelo com um lote existente ou conhecido. Um complemento de coelho adequado deve apresentar uma leitura de potência 8 com o controlo positivo e a maioria das reacções positivas. O mesmo deve apresentar uma leitura de potência 1 com o controlo negativo e a maioria dos reservatórios negativos A exposição a CO 2 deve ser evitada devido a possíveis alterações de ph que podem ser anti-complementares A existência de reacções cruzadas é conhecida no sistema de HLA e a mesma pode resultar em algumas reacções positivas falsas. Alguns dos antisoros no conjunto de tabuleiros de classificação de HLA apresentam uma especificidade ampla (supertípica). Estes antisoros estão definidos na ficha técnica Os testes de HLA utilizando os tabuleiros de classificação de HLA da Invitrogen têm de ser efectuada na presença de um director, supervisor técnico e/ou supervisor geral qualificados, obedecendo a normas laboratoriais homologadas. Compete-nos sublinhar que estes produtos se destinam apenas a utilização profissional.

5 11.7 As amostras devem ser armazenadas à temperatura ambiente até à respectiva utilização e não deve ser utilizado EDTA como anticoagulante para a colheita de amostras Todos os resultados de tipagem devem ser confirmados usando outro método de tipagem. PR006 Revisão 05 Impressão 08/08

6 European Representative: Invitrogen Ltd. 11 Bassendale Road Croft Business Park Bromborough, Wirral CH62 3QL, U.K. Tel: Invitrogen Corporation 9099 North Deerbrook Trail Brown Deer, Wisconsin USA Tel: (800) Fax: (800) Produtos Auto-Declarados (CE aprovado) HLA C Locus Tabuleiros de Classificação

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